水稻染色质变构因子DDM1对DNA甲基化和基因表达的调控功能研究

发布时间：2020-05-14 17:41

【摘要】：基因组DNA包含了细胞的绝大部分遗传信息,在真核生物细胞中,DNA缠绕在组蛋白八聚体上形成核小体,核小体进一步凝聚成染色质。DNA和组蛋白上的共价修饰也会影响相应区段基因的转录,构成了DNA序列以外影响基因表达的另外一层信息。水稻基因组的重复序列和转座子元件占基因组的40%左右,并且很多转座子序列与基因相邻,而DNA甲基化主要发生在重复序列和转座子元件上,所有水稻中DNA甲基化对调控基因表达和生长发育非常重要。本博士论文详细地分析了水稻幼苗组织中基因组DNA甲基化图谱,研究了水稻染色质变构因子DDM1在维持基因组DNA甲基化中的功能以及调控水稻基因表达及生长发育的机制。水稻中有两个DDM1的同源基因OsDDM1a和OsDDM1b,它们的蛋白质序列和CDS的一致性都非常高。我们得到两个基因的单突变体,并将osddm1a和osddm1b突变体杂交得到osddm1a/1b双突变体,与野生型相比单突变体没有明显表型变异,双突变体表型为植株变小,株高只有野生型的1/4左右,且雌雄不育,不能结实。对突变体和野生型发芽12天的叶片进行全基因组甲基化测序发现,osddm1a和osddm1b突变体DNA甲基化水平分别降低9.7%和16.5%,而双突变体总体甲基化降低了54%,其中CG、CHG和CHH(H=A、T和C)甲基化水平分别降低44.9%、73.5%和49.1%。水稻基因组中CG和CHG甲基化主要分布在染色体着丝粒及周边区域(异染色质区域),CHH甲基化则在常染色质有更多的富集。非转座子基因的gene body及其3’-UTR和5’-UTR都有较高的CG序列甲基化,CHG和CHH序列甲基化主要分布在3’-UTR和5’-UTR,在osddm1a/1b双突变体中,基因中的CG、CHG和CHH序列的DNA甲基化都明显降低。转座子相关基因(TEGs)和转座子序列上有非常高的CG(80%)和CHG(80%左右)甲基化,在osddm1a/1b双突变体中CG(40%左右)和CHG(20%)甲基化降低非常显著。在osddm1a/1b双突变体中,小转座子上CHH甲基化降低,而长的转座子上CHH甲基化增加。OsDRM2是CHH序列甲基转移酶,突变后导致全基因组CHH甲基化降低。比较两个突变体CHH甲基化的变化,发现常染色质CHH甲基化在osddm1a/1b双突变体和osdrm2突变体中都降低,osddm1a/1b双突变体中CHH序列甲基化降低的位点与osdrm2突变体CHH序列甲基化降低的位点完全重合,说明OsDDM1和OsDRM2共同参与常染色质CHH甲基化的维持。我们对野生型和osddm1a/1b双突变体发芽12天的叶片进行转录组测序(RNA-seq),研究DNA甲基化缺失对基因表达的影响。RNA-seq数据分析表明双突变体中表达上升4倍的基因有1453个,表达下调的有141个。表达上调的基因中有60%(859/1453)的基因属于TEGs,其中80.3%(687/859)的TEGs和34%(200/594)的非转座子基因CHG甲基化水平非常显著降低,表达上调非转座子基因有较高的H3K9me2修饰。说明OsDDM1主要通过维持CHG甲基化抑制转座子基因以及异染色质非转座子基因的表达。osddm1a/1b双突变体中着丝粒区域和一些长的转座子上的CHH序列甲基化增加,说明OsDDM1抑制异染色质CHH甲基化。RNA介导的DNA甲基化途径(RdDM)参与CHH甲基化的起始和维持,sRNA在RNA介导的DNA甲基化途径中非常重要。我们对突变体和野生型材料进行sRNA测序(sRNA-seq),分析osddm1a/1b双突变体中CHH甲基化的变化和sRNA的关系,发现osddm1a/1b双突变体中CHH甲基化的变化和24nt siRNA变化呈正相关的关系,osddm1a/1b突变体中CHH甲基化的变化与RdDM相关的。我们构建OsDDM1和RdDM途径的CHH甲基转移酶OsDRM2的突变体,对osddm1a/1b/drm2三突变体进行全基因组亚硫酸盐测序,分析发现三突变体中基因组总体DNA甲基化以及CG、CHG甲基化相对于osddm1a/1b有更加明显的降低,并且osddm1a/1b双突变体中增加的CHH甲基化在三突变体中也降低了,说明RdDM介导了osddm1a/1b中CHH甲基化的增加,OsDDM1和OsDRM2共同维持基因组的DNA甲基化。
【图文】：

序列,调控机制,基因表达,表观

图 1 基因表达的主要表观调控机制(Rajender et al 2011)Fig.1 Major epigenetic regulation mechanisms of gene expression.2.2.1 DNA 甲基化高等生物的 DNA 甲基化主要发生胞嘧啶第五位碳原子上。哺乳动物的 DNA 化主要发生在对称的 CG 序列上，基因组中大约 70%-80%的 CG 序列是甲基化的而少量非 CG 序列的 DNA 甲基化存在胚胎干细胞中，非甲基化 CG 序列主要分基因启动子附近的 CG 岛(Law and Jacobsen 2010) 。植物 DNA 甲基化的分布与存在明显差异，植物 DNA 甲基化发生在胞嘧啶的三种序列上：对称的 CG 和 CH列和非对称的 CHH 序列（H=A、T 和 C）(Henderson and Jacobsen 2007)。且 DN基化主要分布在转座元件和重复序列上(Zhang et al 2006)。由于不同物种基因组复序列和转座子元件的比例不一样，它们的 DNA 甲基化水平是不一样的。拟

序列,甲基化酶,结构示意图,甲基化

它的 CG、CHG、CHH 甲基化水平分别 39.9%、23.7%、4.7% (Hu et al 2014)。水稻基因组的 DNA 甲基化水平比拟南芥高很多，但低于玉米，这也与三个物种基因组中重复序列和转座元件的比例是相符合的。研究表明植物 CG、CHG、CHH 三种序列的 DNA 甲基化是由不同的 DNA 甲基转移酶催化维持的。植物中 CG 序列甲基化通过 DNA 甲基转移酶 MET1（METHYLTRANSFERASE 1）维持，它与哺乳动物中的 DNMT1 同源；CHG 序列甲基化是通过植物特有的 DNA 甲基转移酶 CMT3（CHROMOMETHYLASE 3）维持； DRM2(DOMAINS REARRANGED METHYLTRANSFERASSE 2) 和 CMT2（CHROMOMETHYLASE 2）共同维持 CHH 甲基化，DRM2 在哺乳动物同源基因为 DNMT3，参与 RNA 介导的 DNA 甲基化途径（RdDM）负责甲基化的起始。(Chanet al 2005; Law and Jacobsen 2010; Yang et al 2017; Zemach et al 2013) （图 2）。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S511

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