沉默eIF4Al基因对体内外胃癌SGC-7901细胞的影响及其机制探讨

发布时间：2020-05-14 16:29

【摘要】：目的:探讨沉默eIF4A1基因对胃癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的生物学行为和胃癌裸鼠移植瘤模型的影响及其可能作用机制。方法:在37℃、5%CO_2细胞培养箱中,用含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基常规培养人胃癌SGC-7901细胞。取对数生长期胃癌SGC-7901细胞每孔3.5×10~5个接种于6孔板。当细胞融合度达到40%-60%时,按转染说明书步骤,分别将eIF4A1基因沉默重组慢病毒颗粒LV-EIF4A1-RNAi(44682-1)、LV-EIF4A1-RNAi(44683-1)、LV-EIF4A1-RNAi(44684-1)和对照慢病毒颗粒CON077分别感染人胃癌SGC-7901细胞,分别标记为沉默组(eIF4A1-RNAi)(2、3、4)和阴性对照组(CON077),另外设立一组未做任何处理的SGC-7901胃癌细胞作为空白对照组(control)。转染后,用嘌呤霉素筛转染细胞并选出稳定转染株。用实时荧光定量PCR检测各组人胃癌SGC-7901细胞eIF4A1基因的相对表达量,筛选出eIF4A1表达量最低为实验所用的沉默组(eIF4A1-RNAi),并检测该沉默组(eIF4A1-RNAi)与阴性对照组(CON077)和空白对照组(control)的AKT基因的相对表达量。用CCK-8法检测初始样本量为4×10~3个的各组人胃癌SGC-7901细胞的增殖能力;用流式细胞仪检测各组人胃癌SGC-7901细胞5×10~6个细胞的凋亡情况和1×10~6个细胞的周期分布;用Transwell实验分别检测各组人胃癌SGC-7901细胞迁移和侵袭能力;Western blot检测各组细胞eIF4A1和AKT的蛋白表达水平。取4周龄裸鼠24只,随机分成3组。取对数生长期的各组人胃癌SGC-7901细胞,调整细胞浓度为1.5×10~6个/ml,分别于每只裸鼠的左上肢腋窝下接种200ul。常规饲养,每天观察并记录裸鼠精神、营养等状态,成瘤后隔三天测量记录瘤体体积。21天后用颈椎脱臼法处死各组裸鼠,取出各组裸鼠的皮下瘤、肝脏、肺脏组织并浸泡于10%福尔马林中,24小时后做成蜡块组织。把各组裸鼠的皮下瘤、肝脏、肺脏蜡块组织切片,HE染色后,观察其组织的病理改变。把取各组裸鼠的皮下瘤蜡块组织切片,用免疫组织化学检测方法,检测各组裸鼠组织切片的eIF4A1蛋白表达。结果:实时荧光定量PCR检测显示LV-EIF4A1-RNAi(44683-1)组eIF4A1基因的相对表达量最低为0.31±0.04,低于空白对照组(control)的表达量的0.5倍,符合实验要求,选择该组为eIF4A1沉默组(eIF4A1-RNAi);CCK-8实验检测发现沉默组(eIF4A1-RNAi)细胞增殖活力明显低于阴性对照组(CON077)组和空白对照组(control);流式细胞仪检测发现沉默组(eIF4A1-RNAi)细胞凋亡率明显比阴性对照组(CON077)和空白对照组(control)高,并且沉默组(eIF4A1-RNAi)与阴性对照组(CON077)和空白对照组(control)比较,细胞更多处于S期,G_1/G_2期细胞则相对减少;Transwell实验发现较阴性对照组(CON077)和空白对照组(control),沉默组(eIF4A1-RNAi)细胞的迁移、侵袭能力下降;Western blotting检测发现,较阴性对照组(CON077)和空白对照组(control),沉默组(eIF4A1-RNAi)的eIF4A1和AKT基因的蛋白表达明显降低;构建裸鼠皮下瘤模型,发现较阴性对照组(CON077)和空白对照组(control),沉默组(eIF4A1-RNAi)裸鼠皮下瘤增长速度明显减慢;免疫组化实验显示,较阴性对照组(CON077)和空白对照组(control),沉默组(eIF4A1-RNAi)eIF4A1和AKT的表达量明显降低。CON077组与control组比较,上述指标差异均无统计学意义(P0.05)。结论:沉默eIF4A1基因能提高人胃癌SGC-7901细胞凋亡率,抑制增殖、迁移和侵袭能力、使细胞周期阻滞于S期,沉默eIF4A1基因能够抑制人胃癌裸鼠皮下瘤模型肿瘤的生长速度,其机制可能与eIF4A1抑制AKT的表达量相关。
【图文】：

照片,细胞转染,荧光,质粒

首先于普通光镜下观察细胞的数量及分布情况，并进行拍照录。调换为荧光模式并进行曝光时间及灯光亮度的调节，当视野达到最晰后，，观察荧光细胞的数量及分布情况，然后在与普通光镜相同视野下行拍照记录。用显微镜自带的软件将两张照片融合在一起，以此来比较视野下的细胞荧光率。移动六孔板，并在不同视野下拍照对比，并对病转染细胞的效率进行初步的评估，并做好记录（见图 1）。对转然后细胞反复多次观察，并拍照融合对比各组细胞的荧光率后，发现沉默组eIF4A1-RNAi2）、沉默组（eIF4A1-RNAi3）、沉默组（eIF4A1-RNAi4性对照组（CON077）转染效率都在 85%以上，因此说明此次病毒转染细实验成功，转染后的细胞可以用来进行后续的实验。

细胞活力,胃癌,SGC-7901细胞,细胞周期

图 2 各组胃癌 SGC-7901 细胞的细胞活力的变化Figure 2 Changes in cell viability of gastric cancer SGC-7901 cells in each grou4 沉默 eIF4A1 基因对人胃癌 SGC-7901 细胞周期的影响用流式细胞仪检测各组细胞周期结果显示各组细胞周期（G1占比分别为：eIF4A1-RNAi 组（52.07±0.73、15.00±0.76、32.93±0.25）组（56.28±0.53、7.67±0.44、36.05±0.86）、control 组（56.68±1.87、735.44±1.39）。与 CON077 组和 control 组比较，可见下调 eIF4AeIF4A1-RNAi 组细胞处在于 S 期比例增加，而处在 G1、G2的细胞所降低，差异均有统计学意义(P ＜0.05（)见图 3）。而 CON077 组组比较差异无统计学意义（P＞0.05)。
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.2

【相似文献】