狐狸毛色基因TYR、CBD103、MITF启动子活性探究

发布时间：2020-05-14 13:19

【摘要】：酪氨酸酶基因(Tyrosinase,TYR)、β-防御素103基因(Defensin beta 103B,CBD103)及小眼畸形相关转录因子(Microphthalmia-associtated transcription factor,MITF)是调控动物被毛颜色的主效基因。多彩的毛色不仅对于动物自身趋利避害、相互识别和求偶等方面有重要的作用,同时对于毛皮产品的生产和加工及其经济价值有重要影响。在基因表达调控中,启动子不仅能决定基因转录起始,还能调控基因表达的强弱,但在狐狸的相关研究中鲜有报道。因此,本研究利用生物信息学方法、分子克隆、细胞瞬时转染、双荧光素酶报告系统及点突变技术对影响北极狐毛色形成的TYR、CBD103和MITF基因启动子转录活性进行研究。研究结果为揭示各基因调控北极狐被毛颜色分子遗传机制提供理论依据,同时对于揭示北极狐被毛颜色的遗传多样性有重要意义。本研究利用生物信息学方法结合PCR克隆技术首次获得北极狐CBD103、MITF-M和TYR基因5′侧翼区及全部编码区序列。扩增获得:CBD103基因2 327bp(5′侧翼区2 071 bp、CDS区204 bp、3′侧翼区52 bp);MITF-M基因3 880bp(5′侧翼区2 262 bp、CDS区1 260 bp、3′侧翼区358 bp);TYR基因4 300bp(5′侧翼区2 681 bp、CDS区1 593 bp、3′侧翼区26 bp)。并构建了多个不同长度的5′缺失启动子双荧光素酶报告基因表达载体,同时转染A375和293T细胞,通过双荧光素酶检测体系检测这3个基因启动子活性,确定各基因启动子的功能序列位置,并对该位置的转录因子结合位点分别进行定点突变,探究转录因子结合位点在该基因转录调控中的作用。结果表明:1.CBD103基因缺失片段1 656 bp(-1 604/+51)区域的活性值最高,该区域的3个转录因子结合位点Sp1(-1 552/-1 564)、Sp1(-1 439/-1 454)和Sp1(-329/-339)突变后,与野生型相比启动子活性明显下降。表明这3个位点为CBD103基因转录的正调控区域。2.MITF-M基因缺失片段524 bp(-510/+13)区域的活性值最高,-222/-510区域为MITF-M基因的核心启动子区域,该区域的3个转录因子结合位点CREB(-312/-319)、Sp1(-295/-307)和Sp1(-249/-262)突变后,与野生型相比启动子活性显著上升。推测:(1)这3个位点为MITF-M基因的负调控区域;(2)这3个位点为MITF-M基因的正调控区域,但由于该位点发生DNA甲基化修饰,阻碍CREB和Sp1与其结合,抑制转录激活MITF-M基因启动子的活性。3.TYR基因缺失片段2 066 bp(-2 033/+32)区域的活性值最高,该区域的3个转录因子结合位点Sp1(-1 775/-1 785)、NF-1(-199/-208)和Sp1(-119/-129)突变后,与野生型相比启动子活性显著下降。表明这3个位点为TYR基因转录的正调控区域。本研究最终确定北极狐CBD103、MITF-M和TYR基因启动子区域及相关转录因子结合位点在该基因转录调控中的作用。
【图文】：

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极狐 DNA 样品究所用北极狐皮肤组织样品由河北省秦皇岛市昌黎县金岛株究所用菌株大肠杆菌 DH5α 购自宝生物工程（大连）有限公司粒（载体）D 18-T Vector（Simple）载体购自宝生物工程（大连）有限公司载体（pGL3-Basic）、海肾荧光素酶载体（pRL-TK）和阳性-Control）均为北京原平皓生物技术有限公司赠送。 18-T Vector（Simple）：载体全长 2 692 bp。pMD 18-T VectorCR 产物 (TACloning) 的专用载体，（见图 2-1）。

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虫荧光素酶载体（pGL3-Basic）：序列全长 4 818 bp，含）、多克隆位点和 SV40 poly A 信号等，但不存在真核启通过在 Luc 基因上游插入目的片段表达荧光素酶活性，（
【学位授予单位】：河北科技师范学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q953

【参考文献】