烟草赖氨酸脱羧酶基因NtLDC1的克隆和表达分析

发布时间：2020-05-15 08:17

【摘要】：赖氨酸脱羧酶(lysine decarboxylase,LDC)是生物碱合成第一步所需的关键酶。为研究LDC基因在烟草中特性和功能,本研究采用同源克隆和RT-PCR方法从栽培烟草‘K326’中克隆得到一个LDC基因,命名为Nt LDC1,Gen Bank登录号为KU507075。序列分析表明烟草Nt LDC1基因ORF全长666 bp,编码221个氨基酸的蛋白,相对分子质量为24 264.9 Da,等电点为5.43。不同植物中LDC蛋白较为保守,Nt LDC1与番茄和马铃薯的LDC蛋白高度相似,进化分析表明Nt LDC1与番茄中LDC的亲缘关系最近。利用实时荧光定量PCR对Nt LDC1基因进行组织表达分析,结果显示Nt LDC1基因在烟草根、茎、叶、花中均有表达,在叶片中的表达水平最高。低温可以诱导Nt LDC1基因的表达,在低温处理8 h基因的表达量达到最高,表明Nt LDC1可能在烟草低温胁迫应答中发挥作用。
【图文】：

烟草,PCR扩增

和3次实验重复,PCR反应体系和反应程序参照TaKaRa定量PCR试剂盒说明书。对溶解曲线、扩增效率和相关系数进行分析,选取特异性好、扩增效率接近1的引物进行实验,分析NtLDC1基因在烟草不同组织中及不同低温处理时间的表达情况。将茎中和低温处理0h的叶片的相对表达量分别设置为1,其余组织中相对表达量按照2-CT法进行计算。实验结果1NtLDC1基因的克隆以栽培烟草‘K326’的cDNA为模板进行PCR扩增,获得与预期片段大小(666bp)一致的条带(图1)。同时,以‘K326’的基因组DNA为模版进行PCR扩增获得4542bp大小的片段(图1)。为分析NtLDC1基因的结构,将其cDNA序列与克隆获得的基因组序列进行比较,结果显示NtLDC1基因包含7个外显子和6个内含子(图2)。将该基因和蛋白的序列提交到NCBI数据库中,图1烟草NtLDC1基因的PCR扩增结果Fig.1ThePCRamplificationresultsofNtLDC1genefromN.tabacumM1:100bpLadderMarker,M2:DL5000Marker;1~3泳道为cDNA模板的PCR产物,4、5泳道为基因组DNA模板的PCR产物。

示意图,基因结构,示意图

该基序很可能具有重要功能。经过蛋白同源检索,发现来自不同植物物种的LDC蛋白有很高的相似性,与烟草LDC1蛋白序列覆盖度为80%~100%,序列一致性为78%~98%。其中,烟草LDC1蛋白与茄科植物番茄、马铃薯具有98%~100%的序列覆盖度和92%~95%的序列一致性,与锦葵科植物棉花序列一致性最高,为98%,但序列覆盖度较低,为90%,综上可以看出烟草LDC1与番茄和马铃薯LDC蛋白相似度最高。选择部分功能注释明确的、有文献报道的以及模式植物拟南芥和水稻的LDC蛋白序列,利用ClustralX进行序列比对,用MEGA5.0进行系统进化树的绘制(图9),图2NtLDC1的基因结构示意图Fig.2ThegenestructureschematicdiagramofNtLDC1上图为基因全长,方框表示外显子,折线表示内含子,下图为ORF全长。

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