一种Bt基因融合策略在治理害虫对转基因玉米和水稻抗性中的应用

发布时间：2020-05-15 10:15

【摘要】：自从1996年第一批遗传改良农作物商业化种植以来,转基因农作物的种植历史已经跨越了整整20个年头。至今,全球范围内转基因农作物的累计种植面积已经超过20亿公顷,各个国家的农民因此而获得的利益累计超过1500亿美元。第一代Bt转基因农作物只含有单个的抗虫基因,经过多年的单一化种植后,许多地方出现了抗性害虫和次要害虫的爆发;在我国,Bt农作物绝大多数是含有单个Cry1Ac蛋白的抗虫棉花,近年来已经陆续出现抗性棉铃虫(Helicoverpa armigera)和棉红铃虫(Pectinophoragossypiella)等的发生。提升害虫治理的策略、发展第二代甚至第三代Bt转基因农作物的工作迫在眉睫。传统上,治理害虫抗性的方法有“高剂量/庇护所”(high-dose/refuge)策略和“基因堆叠”(pyramids)策略。前者注重农业的生产方法,后者则是提高产品自身的性能。基因堆叠的方法可以是将二个或者二个以上表达单个Bt基因的转化体通过杂交聚合在一个品种中,也可以通过在同一个T-DNA构建几个串联的开放阅读框而实现。但是,这样获得的转基因株系中容易出现不同Bt蛋白之间表达量差异大、启动子的同源沉默等情况。鉴于此,本研究首次设计并改良了一种Bt基因融合策略,将两种不同类型的Bt基因整合成一个融合基因,导入到农作物玉米和水稻中,使得转基因农作物能够同时、等量、稳定地获得两种Bt蛋白的抗虫能力;同时分别设计编码两种不同长度连接肽的序列,插入到两个基因的连接处,使得转基因农作物中能够稳定表达完整的、全长的抗虫融合蛋白。本研究选用了一种Cry蛋白和一种Vip3蛋白,将其核苷酸序列融合;使用的Cry蛋白是商业化最成熟的Bt杀虫晶体蛋白之一 Cry1Ab,已经成功在玉米、棉花等农作物上商业化生产;Vip3蛋白是本课题组自主研发的高效抗虫蛋白Vip3da,这是一种Bt营养期杀虫蛋白;这两种蛋白的抗性机理是完全不一样的。本课题组早前在研究过程中发现,这两个基因直接串联转入植物后,转化事件中往往无法检测到全长的融合蛋白。因此,本研究设计了两段连接肽分别用于连接两个基因:一段是由八个非极性氨基酸组成的短肽linker,另一端是来源于玉米几丁质酶两个结构域之间的连接序列(Chitinaselinker,CL)。这两段连接肽都没有生物活性,只起到连接的作用,用于避免Cry1Ab蛋白与Vip3da蛋白的三维结构发生挤压和拮抗、从而导致融合蛋白的降解;含有短肽linker的融合基因命名为CAL,含有Chitinaselinker的融合基因命名为CACL。对原核表达蛋白的生物活性测定结果显示,CAL与CACL蛋白兼具有Cry1Ab蛋白和Vip3da蛋白的活性和杀虫谱,对Cry1Ab无法杀灭的小地老虎和粘虫,CAL/CACL具有良好的杀虫活性。本研究构建了具有抗虫融合基因的T-DNA载体,并以不同的启动子启动抗虫融合基因在玉米和水稻中的表达。研究结果显示,具有编码连接肽序列的融合基因转入玉米和水稻后,转基因植株中可以检测到完整的、全长的抗虫融合蛋白,并且植株具有相应的抗虫活性。最终,筛选出了 SL34和SL21这两个玉米转化株系,以及A1L、SL6和SL14三个水稻转化株系。对这些转化株系进行分子特征的鉴定,并测定了它们的外源蛋白表达量、T-DNA插入位点和拷贝数等信息,并利用棉铃虫、粘虫和小地老虎等主要的鳞翅目害虫测定了它们的生物活性,为后续的商业化应用提供依据。
【图文】：

遗传改良,农作物种植面积,全球,变化趋势

和Ｂｔ邋１１，杜邦先锋育种公司（Ｐｉｏｎｅｅｒ邋Ｈｉ－Ｂｒｅｄ邋Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ邋Ｉｎｃ．）的抗甲虫玉米逡逑ＨｅｒｃｕｌｅｘＴＭ和抗除草剂玉米Ｏｐｔｉｍｕｍ？，等等。在２０年的发展历程中，遗传改良逡逑农作物的种植面积始终呈线性增长状态（图１．１），而且自２０１１年开始，发展中逡逑国家的种植面积逐渐超过发达国家；截至２０１５年，全球转基因农作物的种植面逡逑积已经达到了约１．８亿公顷，这一数字在１９９６年仅为１７０万公顷，增长面积超逡逑过１００倍，２０年累计种植面积已经超过２０亿公顷，各个国家的农民们因此而获逡逑得的利益累计超过１５００亿美元［４］。遗传改良农作物商业化种植的成功，不仅给逡逑农民们带去了显而易见的收益，而且对环境保护也起到了非常积极的作用，各种逡逑化学农药的使用量因遗传改良农作物的种植而减少了邋３７％，作物产量却提高了逡逑２２％［７］0逡逑ＧＬＯＢＡＬ邋ＡＲＥＡ邋ＯＦ邋ＢＩＯＴＥＣＨ邋ＣＲＯＰＳ逡逑Ｍｉｌｌｉｏｎ邋Ｈｅｃｔａｒｅｓ邋（１９９６－２０１５）逡逑Ｔｏｔａｌ邋Ｈｅｃｔａｒｅｓ逡逑２００－Ｑ－Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ逦■邋２８邋Ｂｉｏｔｅｃｈ邋Ｃｒｏｐ邋Ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ逡逑１８0＿逦＾邋Ｄｅｖｅｌｏｐ

示意图,毒素,示意图

逦Ｉ逡逑Ｈ三ｎｒ三三三一邋■一三ｙ丨＝三三－匚三三逡逑＂＂■＝＿—＝逦ｚｊｚ邋二二邋＿————逡逑ＣｙＴ＾ｆｆｉ逡逑ＩＩ邋ＩＩ逦ＩＩ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋ｌｃｙ？邋！？：逦■逦ｎ邋Ｉ邋Ｉ邋ＩＩ逦ＩＩ逦ｒ￣ｒ￣逡逑图１．４部分Ｃｒｙ和Ｃｙｔ毒素的杀虫谱。目前已有几十种Ｃｒｙ和Ｃｙｔ蛋白被报道具有杀虫活逡逑性，其中白色表示没有活性，黑色表示具有杀虫活性，灰色表示具有部分活性。这些Ｂｔ毒逡逑素是生物抗虫技术丰富的资源库。［１２］逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．４邋Ｔｈｅ邋ｓｐｅｃｔｒｕｍ邋ｏｆ邋ａ邋ｐａｒｔ邋ｏｆ邋Ｃｒｙ邋ａｎｄ邋Ｃｙｔ邋ｔｏｘｉｎｓ逡逑１．２．３邋Ｂｔ毒素的分类、命名与多样性逡逑根据Ｂｔ毒素命名委员会（Ｂｔ邋Ｔｏｘｉｎ邋Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ邋Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）［２３］的统计数据，，逡逑Ｂｔ毒素家族目前已经发现并命名了超过３００种蛋白［１７］，每年都会有新的毒素被逡逑发现和命名。如何对数量庞大的毒素进行准确、统一、合理的命名，曾经是困扰逡逑科学家们的一大争论。现行的命名体系的分类依据是氨基酸序列的相似度（同源逡逑性）
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S435.11;S435.13

【相似文献】