X连锁显性遗传型Alport综合征COL4A5基因突变对足细胞功能的影响

发布时间：2020-05-16 13:23

【摘要】：Alport综合征(Alport Syndrome,AS)是以眼、耳、肾病变为临床特征的先天/遗传性肾脏病,是导致儿童终末期肾病(End-stage renal disease,ESRD)的主要原因之一。对儿童而言,AS由于起病隐匿,临床表现多样,病理表现不典型等特点极易误诊或漏诊,基因诊断在AS早期诊断中具有重要价值。目前已发现COL4A5基因突变是X连锁显性遗传型Alport综合征(X-linked Alport Syndrome,XLAS)发病的主要原因,并且足细胞在疾病的发生发展中起着重要作用,但是不同COL4A5基因突变对足细胞形态和功能的影响仍不明确。所以,本研究将对COL4A5基因突变的AS患儿临床特征和基因突变的特点进行总结分析,以期减少临床漏诊的发生;同时从COL4A5基因突变对人足细胞功能影响入手,为AS的基因诊断及发病机制提供新的实验依据。第一部分:COL4A5突变Alport综合征儿童临床表型分析目的:对COL4A5基因突变的XLAS患儿基因型和临床表型进行总结,以期提高对Alport综合征的认识。方法:回顾性分析2011年6月-2016年6月上海交通大学附属儿童医院(上海市儿童医院)肾脏风湿科确诊的COL4A5基因突变的XLAS 31例,通过收集临床特征、实验室检查、病理诊断等资料,同时利用SPSS软件对上述数据进行统计学分析。结果:(1)31例COL4A5基因突变的XLAS患儿中女性12例(38.7%),男性19(61.2%)例,平均发病年龄2.6岁。临床上以血尿蛋白尿为首发表现者男孩多于女孩,本组男性11例(11/19),女性仅2例(2/12)(P0.05)。而男性与女性患儿的发病年龄、阳性家族史、诱因及眼耳病变等差异无统计学意义(P0.05)。(2)26例在B超引导下行经皮肾穿刺活检检查,肾组织病理光镜提示20例表现为轻微病变,5例系膜增生,1例局灶节段性硬化;电镜结果仅4例(26.7%)出现典型AS基底膜改变;IV型胶原α链荧光染色,60%患儿(共15例)α3、α5均阴性。(3)本组共检出31种基因突变,其中19例错义突变,2例大片段删除,4例剪切位点突变,6例框移突变。19例错义突变中16例突变为Gly-X-Y型突变。31例患儿基因突变中发现新发突变11例,占35.4%。结论:儿童XLAS起病隐匿,多以血尿或血尿合并蛋白尿发病,临床表型无明显特异性,病理表现不典型(多为轻微病变),COL4A5基因突变以错义突变最为多见,且新发突变率较高,给AS诊断造成困难,而基因检测有助于提高AS的检出率。第二部分:COL4A5基因突变对足细胞功能的影响通过第一部分的研究我们发现,由于XLAS患儿发病时临床表现无明显特异性、病理组织形态不典型易造成临床漏诊,COL4A5基因突变检测作为XLAS新的诊断标准之一,有助于提高AS的检出率,但如何明确突变基因的致病性,也是困扰临床医师的热点问题之一。现已发现800多种COL4A5基因突变,却鲜有基因突变的功能验证报道,为了进一步明确COL4A5基因突变的致病性及其对足细胞功能的影响,以有明确家族遗传史患儿的COL4A5剪切突变c.232-1GA突变为例,尝试探讨突变基因对足细胞特异性分子及IV型胶原蛋白表达的影响,为将来临床上开展基因突变的验证提供新的线索。目的:探讨COLA45基因剪切位点突变c.232-1GA对足细胞IV型胶原表达和细胞功能的影响,从而为临床诊断提供新的依据,为疾病发生机制提供新的线索。方法:(1)实验对象:人肾小球足细胞株,由Moin Saleem教授惠赠,实验条件为37℃分化12-14天的足细胞,细胞铺板为转染前24小时内。(2)实验分组:随机分为四组,空白对照组、空载体组、正常质粒组和突变质粒组。以pcDNA3.1为载体设计质粒,COL4A5突变质粒除c.232-1GA突变位点外,其余COL4A5基因序列皆与正常COL4A5质粒相同。(3)实验内容:1)人肾小球足细胞培养及间接免疫荧光法鉴定足细胞表达nephrin和synaptopodin状况。2)实时定量荧光PCR法及Western blot法分别检测各组足细胞COL4A5/COL4A3/COL4A1 mRNA及蛋白表达水平。3)Western blot法检测各组足细胞特异性分子podocin和α-actinin-4表达。(4)统计方法:应用SPSS统计软件,所有计量资料均采用均数±标准差((?)±s)表示。组间两两比较,先检验数据均符合正太分布后采用单因素方差分析LSD方法分析,P0.05为差异具有统计学意义。结果:(1)成功培养了人足细胞,且表达人足细胞特异性标志物(Nephrin、Synaptopodin)阳性。(2)COL4A5基因c.232-1GA突变质粒转染后足细胞表达COL4A5蛋白及mRNA水平均明显下降(与对照组相比,P值分别小于0.01和0.05)(Western blot、间接免疫荧光、qPCR);而对COL4A3、COL4A1的mRNA和蛋白表达水平无影响(P0.05)。(3)COL4A5基因c.232-1GA突变质粒转染后,足细胞表达podocin蛋白明显降低(P0.05)(Western blot法),而不影响α-actinin-4的表达水平(P0.05)。结论:COL4A5基因c.232-1GA突变致足细胞COL4A5蛋白及隔膜裂孔蛋白podocin表达下调,可能通过影响足细胞功能而致病,但确切机制有待阐明。
【图文】：

家系图,家系图,尿蛋白

为了明确 COL4A5 突变基因对足患儿的 COL4A5 剪切突变 c.232-1G子及 IV 型胶原蛋白的影响，为将来生后 1 年因尿频就诊，尿常规提示尿蛋白定性 2+-3+，24h 尿蛋白定血肌酐 19umol/L，泌尿系 B 超提示mHg，无眼部及耳部病变；家族中存在尿蛋白（++），潜血（++），功能异常。患儿于我院肾活检，肾光 IV 型胶原 α1 链阳性，α3 链阴性

形态图,足细胞,形态

（7）将 DAPI 液滴在载玻片上，，用镊子夹起小圆玻片盖在滴有 DAPI 试剂的片上，静置 30min。.7 统计学分析应用 SPSS 统计软件分析，所有计量资料均采用均数±标准差（x±s）表示。两两比较，先检验数据均符合正太分布后采用单因素方差分析LSD方法分析，0.05 为差异显著性，有统计学意义。结果足细胞形态33℃培养条件下的足细胞，细胞体积较小，胞核位于细胞中央，细胞核呈圆足突细短；37℃条件下分化培养 12-14 天左右，足细胞分化成熟，细胞增大，变长向四周伸展，可见二级足突形成。（详见图 3-1）
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R726.9

【参考文献】