毕赤酵母高效表达Streptomyces sp.FA1木聚糖酶基因工程菌构建及发酵优化

发布时间：2020-05-16 12:21

【摘要】：木聚糖酶是糖苷水解酶[EC 3.2.1.x]的一种,可以将木聚糖水解,生成木糖与低聚木糖。在果蔬加工、面制品加工、低聚木糖制备、造纸印染和动物饲料的初级处理等行业中拥有应用价值。由于木聚糖酶在很多领域应用广泛,高效的发酵生产木聚糖酶对工业化具有实际意义。木聚糖酶基因的来源不同,其结构与性质也有很大差别。本实验室在对木聚糖酶的研究中,从链霉菌Streptomyces sp.FA1中得到了一种归属于糖苷水解酶第十家族的木聚糖酶(XynA)。将其在大肠杆菌中克隆,并进行胞外表达。结果显示有大量的包涵体存在。为了可以高效表达木聚糖酶,本课题在毕赤酵母(P.pastoris)中强化表达XynA,通过构建游离型表达质粒表达与整合表达联合应用来强化XynA分泌效率,提高XynA酶活。主要结果如下:(1)通过PCR得到自主复制序列PARS1和PARS2,构建了pMD18-T-PARS1、pMD18-T-PARS2,酶切验证并测序正确。在此基础上构建pAOX1-PARS与pGAP-PARS系列游离型载体:pPICZαA-PARS1、pPICZαA-PARS2、pGAPZαA-PARS1、pGAPZαA-PARS2,酶切验证并测序正确。(2)将木聚糖酶基因整合到游离型质粒,将游离重组质粒电转导入P.pastoris KM71,构建游离型重组菌:P.pastoris KM71/pPICZαA-PARS1-xynA、P.pastoris KM71/pPICZαA-PARS2-xynA、P.pastoris KM71/pGAPZαA-PARS1-xynA、P.pastoris KM71/pGAPZαA-PARS2-xynA,分泌表达XynA。经过摇瓶培养后,测定重组酶XynA的活力,筛选出最佳的游离型重组菌P.pastoris KM71/pGAPZαA-PARS2-xynA,木聚糖酶活最高达到29.6 U·m L-1。(3)对游离型重组菌在3.6 L罐水平进行发酵过程优化,分别以甘油、葡萄糖、蔗糖、混合碳源(蔗糖:甘油=1:2)作为碳源优化游离型重组菌株表达水平。以BSM培养基进行上罐发酵,50%甘油为最适补料碳源,培养96 h后,最高酶活可达350 U·mL~(-1)。同整合型重组菌P.pastoris KM71/pGAPZαA-xynA相比,表达水平提高了45.9%。(4)在整合表达木聚糖酶的基础上,将含有木聚糖酶基因的游离质粒转入菌株,构建P.pastoris KM71/pPIC9K-xynA/pGAPZαA-xynA,实现双启动子共表达(强化型)。通过摇瓶表达,甲醇诱导144 h后,XynA酶活为202 U·mL~(-1),是单一整合型酶活的1.7倍。重组XynA发酵上清液,经过40%(w/v)的(NH_4)_2SO_4沉淀、透析及Mono S阳离子交换柱纯化。对重组酶的酶学性质定性,结果表明:木聚糖酶的最适温度为60℃,55℃下120 h达到半衰期;最适pH为5.5,pH范围3-11放置24 h,其酶活仍有80%左右;浓度为10 mmoL·L~-11 Fe~(3+)对XynA的活性有抑制作用,Mn~(2+)和Cr~(2+)对Xyn A保留约85%的活性。(5)在3.6 L罐上对强化型菌株进行诱导温度,初始诱导菌浓,甲醇诱导浓度三个方面优化。最后得到最佳上罐条件为:在28℃,初始菌浓OD_(600)=100,甲醇的浓度为1.5%(v/v),诱导发酵144 h。XynA酶活达到3030 U·m L~(-1),是单一整合型的2.1倍同时强化型重组酶比活相对整合型表达提高了52.4%。为链霉菌来源的GH10家族木聚糖酶在毕赤酵母中表达的最高水平。
【图文】：

木聚糖,基本结构

糖酶聚糖简介是大自然中含有生物质最丰富的，植物中含有丰富的木质纤维素[1]。木质纤，主要是由木质素、纤维素、半纤维素等组成[2, 3]。半纤维素主要在植物的，半纤维素主要是单糖通过氢键、共价键等构成的异质多聚体，并与纤维联，构成结构稳定并有一定刚度与弹性的网状结构[4]。常见的葡甘露聚糖、葡甘露聚糖等都属于半纤维素[5]。其主链连接方式的不同，木聚糖划分为两大类。第一类是存在于陆生植物洋植物细胞壁中的 β-1,4-木聚糖；第二大类：β-1,3-木聚糖，存在于某些海中[6, 7]。木糖单糖为一个单元，主链通过 β-1,4-糖苷键连接形成木聚糖，阿其主链中的吡喃木糖取代[8]，木聚糖主要结构如图 1-1 所示[9]。木聚糖根据为两类，第一类为硬木木聚糖，硬木木聚糖常在 D-木糖的 C-2 和 C-3 位上]。第二类为软木木聚糖，软木木聚糖比硬木木聚糖分支少，，在 C-3 上连接喃糖[11]。木聚糖侧链结构和成分对木聚糖天然构象、与其他多糖分子结合等理化特性具有一定影响[12]。

代谢途径,甲醇,启动子,诱导型启动子

图 1-2 甲醇代谢途径Fig. 1-2 Methanol metabolism pathway1.2.2 毕赤酵母启动子转录的起始是基因表达的关键因素，启动子作为转录的调控元件，对于基因的表达水平有着重要的影响，直接影响转录的效率[58]。在毕赤酵母表达外源蛋白的系统中，启动子资源相当丰富[59-61]。启动子的选择，对外源蛋白的表达影响很大。在毕赤酵母系统中表达外源蛋白的种类、大小都不尽相同，为了可以高效顺利的表达蛋白，选择合适的启动子至关重要。毕赤酵母表达系统中的启动子主要分为诱导型启动子与组成型启动子。诱导型启动子有着严格的调控基因，只有在特定的诱导剂下，才可以启动，如 AOX1、FLD1。这类启动子有许多优点，最主要的的是它对于表达外源蛋白与菌体生长是非偶联状态。菌体生长并不产酶，不会对菌体生长造成压力，同时切换成诱导剂，前期生物量的积累对后期产酶以及诱导剂毒性对量的影响有一定的帮助。诱导型启动子虽然有很多优点，但是对其诱导剂的专一性在实际生产中也受到了限
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ920.1;Q78

【参考文献】