番茄果实糖代谢中关键SlSWEETs基因的鉴定及其功能验证

发布时间：2020-05-17 03:05

【摘要】：SWEETs(Sugars Will Eventually be Exported Transporters)是高等植物中一类全新的不依赖能量介导糖转运的易化扩散蛋白家族,对调控作物产量形成中碳素转运与分配具有重要意义,目前仅在植物的叶片、花器官鉴定了部分成员的生理功能,而作为重要“库”组织的果实器官中介导蔗糖供给与代谢积累的生理功能和调控机理尚无报道。本文以番茄基因组数据为基础,利用生物信息学方法在番茄中鉴定了SlSWEETs基因家族成员。通过实时定量PCR分析筛选获得了果实特异表达的SlSWEETs基因,并利用Gateway技术构建SlSWEETs-RNAi沉默载体,获得转基因株系并对其进行分析,进一步探讨SlSWEETs在番茄果实成熟过程中调控蔗糖转运的分子机理以及蔗糖积累与糖转化蛋白活性的关系。此外,利用酵母己糖缺陷型突变体验证番茄果实中差异表达的SlSWEETs蛋白所具有的糖转运特性。同时利用mbSUS泛素裂解化酵母膜蛋白双杂系统和BiFC双分子荧光互补系统对筛选出的SlSWEETs蛋白进行互作分析。通过对SlSWEETs基因启动子分析,初步研究在不同激素处理下SlSWEETs的表达模式,并为栽培番茄果实产量和品质的遗传改良提供理论依据及新思路。主要研究结果如下:1.以番茄基因组数据为基础,在番茄中鉴定了29个SlSWEETs基因家族成员,序列比对发现番茄SlSWEETs家族成员均含有7个跨膜结构域,包括2个典型的3-跨膜MtN3保守结构域以及一个连接用的α-螺旋跨膜结构。系统进化树分析SlSWEETs家族成员可以分成典型的四大分支,其中分支I、II和IV成员具有己糖转运能力,而分支III的成员优先转运蔗糖,但是也具有一定的己糖转运能力。通过糖、盐和温度胁迫处理,对SlSWEETs基因的表达模式进行了分析,并筛选出了响应逆境胁迫的SlSWEETs基因。其中SlSWEET1b、-1c、-5b、-6a和-7a可能参与葡萄糖的运输,SlSWEET10a、-10b、-10c、-11a、-11b、-11d、-12a和-12c可能参与果糖的运输,SlSWEET10a、-10b、-10c、-11a、-11b、-11c、-11d和-12c可能在蔗糖的运输过程中起重要作用。SlSWEET1c、-2a、-3、-7a和-14在高温胁迫下起作用,SlSWEET1c、-1f、-3、-5a和-5b可能在低温胁迫下诱导转录,SlSWEET1c、-3、-7a和-14在盐胁迫响应中起重要作用。在此基础上,对比已公开数据库中获得了栽培型番茄“Heinz 1706”(S.lycopersicum)和野生型番茄LA1598(S.pimpinellifolium)的SlSWEETs基因表达谱,筛选出了SlSWEET7a、-11b、-12c和-14这4个在果实高度表达的基因,推测其可能在果实发育成熟过程中发挥着更为重要的作用。2.为进一步验证SWEET在番茄果实中的功能,本实验室构建了4个SlSWEETs基因的沉默载体,并通过农杆菌介导转入Micro-TOM番茄中,经PCR鉴定及目的基因的实时定量PCR分析,已全部获得沉默转基因株系。通过对沉默转基因株系成熟叶片及果实的糖含量测定发现,基因沉默后,成熟叶中的糖含量积累增加,果实的己糖含量也有增加,但是蔗糖含量变化不大,说明SlSWEETs家族成员之间存在功能冗余。对slsweet7a-1和slsweet14沉默转基因株系果实中蔗糖代谢关键酶的表达分析,结果表明,基因沉默后,slsweet7a-1果实内果糖激酶FK和己糖激酶HK的表达量下调,蔗糖代谢相关的酶基因(蔗糖磷酸合成酶SPSA2、细胞壁转化酶LIN、液泡转化酶VI)和糖转运蛋白基因(SlSWEET12c和SlSWEET14)的表达量上调。slsweet14果实内只有蔗糖合成酶SS1和糖转运蛋白SlSWEET12c的表达量上调,而其他糖代谢途径基因的表达量均下调。以上结果说明,SlSWEETs基因被沉默以后,其介导的糖易化扩散活性会受到影响,引起果实中果糖和葡萄糖含量的增加,而对蔗糖含量影响不大。3.成功构建了酵母缺陷型的表达载体pDR195-SlSWEET7a,-11b,-12c,-14,通过转化酵母己糖缺陷型突变体EBY.VW4000,在不同碳源(麦芽糖、葡萄糖、果糖和半乳糖)的SD-ura选择培养基中验证了番茄果实中差异表达的4个SlSWEETs蛋白均具有转运葡萄糖和果糖的特性,但对其他的己糖,如半乳糖并没有表现出明显的转运能力。4.利用mbSUS基于泛素裂解的膜蛋白酵母双杂系统,分别将4个果实差异表达基因连入诱饵载体pMetYC_GW和捕获载体p XN22_GW中,分别转化到THY.AP4和THY.AP5酵母菌中,经筛选培养基鉴定,在酵母二缺SD-Leu-Trp和三缺SD-Leu-Trp-His选择培养基的严格筛选下,分别存在SlSWEET11b和SlSWEET14自激活形成同源二聚体,而SlSWEET7a/11b,SlSWEET11b/14,SlSWEET12c/11b,SlSWEET12c/14和SlSWEET14/11b(Nub-Cub)可以形成异源二聚体。5.利用BiFC双分子荧光互补系统分别将SlSWEET7a、-11b、-12c和-14基因连入pXCGW和pXNGW载体,经烟草叶片瞬时表达后发现SlSWEET11b和SlSWEET12c可以自激活形成同源二聚体,SlSWEET7a和SlSWEET14,以及SlSWEET11b和SlSWEET12c则可以互作形成异源二聚体。这说明具有单个7跨膜结构域的SWEET蛋白分子并不足以在疏水性的质膜上形成一个亲水的通道让葡萄糖等分子通过,这也为揭示小分子载体蛋白在行使功能时普遍具有多聚化现象及高等植物关于MtN3结构域具有自身多聚化形成有功能的结构提供了有力的实验佐证。6.利用番茄果实圆片分别利用赤霉素(GA)、生长素(IAA)、脱落酸(ABA)和茉莉酸(MeJA)进行处理,分别在处理8h和24h后,分析了4个果实差异表达SlSWEETs基因的表达及糖含量变化,结果表明,IAA、ABA和MeJA处理后,SlSWEET11b和SlSWEET14的表达量显著上调,尤其是ABA处理24h后SlSWEET14的表达量极显著增加。SlSWEET14的启动子中包含响应MeJA的作用元件,但是并没有响应ABA的作用元件,说明可能有该途径上的其他基因影响了其表达。孵育试验明确了4个SlSWEETs基因可能参与了激素相关调节途径来响应生长素、脱落酸和茉莉酸的诱导。
【图文】：

乳糖,半乳糖,透性酶,相对稳定时期

1981 在囊泡中纯化的乳糖渗透酶催化糖的转运和积累。1984 磷脂酰乙醇胺参与糖转运所需的全部活动。1998 描述了半胱氨酸突变体；提出一种详细的半乳糖/H+协同转运机制。2003 报道了半乳糖渗透酶的晶体结构。引自 Chen(Chen et aWinkler 和 Wilson(1966)研究发现乳糖透性酶的亲和力对于流入和流出的乳糖，而对于 NPG (O-硝基苯-半乳糖苷)则相差 40 多倍，而 Vmax值没有显著不同在细胞中流出等于流入的固定状态应该达到相当高的浓度。提出这种差异是由生的。Müller-Hill 实验室首先成功克隆得到乳糖渗透酶基因(Bücheletal.,1980)。后来到其它主要家族的第一个糖转运蛋白基因(Celenza et al., 1988;Hediger et al.,ckler et al., 1985; Newman et al., 1981; Riesmeier et al., 1992; Sauer and Tanner, 1，对糖转运蛋白的研究进入相对稳定时期，直到 2010 年 SWEET 的克隆(Chen0)(图 1-1)。

蛋白,己糖转运蛋白,葡萄糖运载体,蔗糖转运蛋白

个关键的糖转运蛋白被鉴定出来，包括己糖转运蛋白 HXTs(Celenza et al.,转运蛋白 GLUTs 和 Na+-葡萄糖协同转运蛋白 SGLTs(Hedigeretal.,1987)，运蛋白 STPs 和蔗糖转运蛋白 SUTs(图 1-2)。除了 SGLTs 其他转运蛋白超家族。而 SWEET 糖转运蛋白广泛存在于古生菌、植物以及人类之中，和 SGLT 转运蛋白，它们通常只有 7 个跨膜结构域。细胞对糖的摄取和外排蛋白介导，这对糖在多细胞生物体内不同细胞、组织和器官的分布有很重而，，真核生物的细胞高度分化，它们需要借助转运蛋白通过这些间隔来摄因此，GLUTs、SWEETs、植物液泡葡萄糖运载体(vacuolar glucose transp)、早期响应疏水转运蛋白(early response to dehydration like transporters, ER膜单糖转运蛋白(tonoplastmonosaccharidetransporters,TMTs)在糖转运过程要的角色(Chen et al., 2015; Horiba et al., 2003; Sauer, N. et al., 1990)。转运蛋白的转运机制过异源表达系统分析、突变体分析、蛋白质纯化以及人工重构合成蛋白质质的转运活性、运输方向进行鉴定。如图 1-2 所示糖转运体的几种主要转运
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S641.2

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