Hras12V转基因小鼠肝肿瘤代谢组学和转录组学联合分析

发布时间：2020-05-17 05:37

【摘要】：目的:探究ras癌基因诱发肝肿瘤发生发展过程中,在代谢组学和转录组学水平上的变化特点,为研究肝肿瘤的发病机制及临床诊断治疗提供有益的线索。方法:1.将Hras12V转基因小鼠肝肿瘤组织和正常小鼠肝组织切成1 cm~3小块,用冰浴的生理盐水冲洗,立即冻存进液氮中用于后续气相质谱分析和总RNA提取实验。剩余的组织存放在10%福尔马林液中,用于组织病理学鉴定,确认是否可以用于后续实验。2.制备气相色谱-质谱分析所需样本,进行GC-MS两个衍生化步骤,混合后上机待测。随后进行GC-TOF-MS检测;然后进行气相色谱-质谱联用设备的分析数据分析,用LECO Corporation和LECO-Fiehn Rtx5数据库的色度TOF4.3X软件用来区分出原始物质,数据用基线过滤及基线校准、峰值对齐、去卷积分析、峰值识别和峰值区域集成,将产生的物质列表输入Pirouette software(模式识别,华盛顿伍丁维尔)用于多变量的统计学分析。将气相液相色谱-质谱列出的物质数据表输入MSEA作为代谢物列表,选择小鼠通路库,同时ORA算法选择超几何检验进行代谢物富集分析。3.检测两组肝组织样本中不同基因mRNA的表达量。抽提待测样本的总RNA,用TruSeq RNA LT样本准备试剂盒制备测序文库,测序用Illumina HiSeq 2000。对UCSC Mouse Reference Genome(http://genome.ucsc.edu/)进行阅读比对用Tophat v1.3.2软件。DAVID v6.7数据库用于测序数据分析和KEGG富集分析。4.实验室对部分代谢物用试剂盒进行检测,包括:NADPH、甘油三酯、胆固醇、丙酮酸、乳酸、胆汁酸、谷胱甘肽和活性氧。以上代谢物检测方法严格按照相关试剂盒说明书进行。所有待测样本进行三次实验。结果:1.肝癌当中富含脂质与大体表型一致,HCC的脂质生物合成是显著增强的;2.糖酵解途径和柠檬酸穿梭的增强提供了充足的乙酰辅酶A;强化的磷酸戊糖途径供应非常多的NADPH;3.脂质从头合成相关性关键性酶活性都上调;与胆汁酸合成有关的重要酶的活性全下调;4.肝癌组织与正常肝组织相比较,NADPH、丙酮酸、甘油三酯、胆固醇以及谷胱甘肽含量显著升高,乳酸含量显著性下降,而活性氧维持在正常水平。结论:在ras癌基因诱导的肝癌中,脂质代谢、糖酵解、磷酸戊糖途径、三羧酸循环、柠檬酸穿梭、胆汁酸合成和氧化还原稳态有显著紊乱,而且这些发生变化的代谢过程对肝癌的发生发展和病理特点有起到关键性作用。
【图文】：

组织病理学,肝组织

组织病理学鉴定由 ras 癌基因诱导的肝癌组织中代谢组学和转录组因雄性小鼠肝肿瘤组织和正常雄性小鼠肝组织作为本和组织病理学研究结果与我们之前的研究报道一色病灶，病灶呈圆形或椭圆形伴有丰富血管，质地ras 转基因雄鼠肝脏病灶是突出肝表面或嵌入肝脏内雄性小鼠肝组织鲜红色，质地有弹性且未见病灶（显示肝癌（通常直径大于 5 mm）有肿瘤细胞小梁排迹象和淋巴细胞浸润迹象（图 1C）。正常肝组织中和炎症细胞浸润（图 1D）。所有的取材实验动物其别了 8 只 ras 转基因雄鼠肝癌组织和 8 只正常雄鼠行后续研究。

肝癌组织,数据,菱形,蓝色

图 2 对肝癌组织和正常肝组织的代谢数据进行 PCA，PLS-DA 和 OPLS-DA 分析注释 2：（A）正常肝组织（用黑色圆点表示），肝癌组织（用蓝色菱形表示），基于两种组织的代谢物配置数据进行 PCA 绘制评分图。主要成分 PC1 (t[1]) 和PC2 (t[2])分别描述了 33.6%和 15.6%变异，每组 n=8。（B）PLS-DA 评分显示出正常肝组织（用黑色圆点表示）和肝癌组织（用蓝色菱形表示）是完全分离的两种组织。分类参数：R2X (cum) = 0.539，R2Y (cum) = 0.951，，and Q2 (cum) = 0.746。（C）PLS-DA 模型验证对正常肝组织（用黑色圆形表示）和肝癌组织（用蓝色菱形表示）进行 200 次数据随机排列，显示 R2 低于 0.515 并且 Q2 低于 0.173。（D）OPLS-DA 显示出正常肝组织（用黑色圆形表示）和肝癌组织（用蓝色菱形表示）之间区别的变量分摊。分类参数：R2X (cum) = 0.816，R2Y (cum) = 0.996，和 Q2 (cum) = 0.874。3 PCA 筛选出的肝癌组织和正常肝组织之间有差异的物质除了基于样本组成的成分得分图以外，PCA 还可以根据代谢物含量生成一个
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.7

【参考文献】