嗜热自养甲烷杆菌Ferredoxin基因对水稻正常生长及逆境胁迫下光合效率的影响

发布时间：2020-05-17 07:33

【摘要】：水稻(Oryza sativa L.)是我国乃至全世界重要的粮食作物,其产量的高低一直成为人们关注的热点问题之一。近年来,非生物胁迫日趋严重,严重影响植物的生长和产量。寻找、筛选和鉴定相关抗性基因,并利用基因工程手段进行水稻抗逆育种是提高水稻抗逆和产量的重要手段。古菌生活于极端环境,蕴含着许多水稻中不具有的包括耐高/低PH、高盐度、高温等基因,若能将这些珍贵的基因资源开发应用到我国重要的粮食作物中,将会对农作物的常规抗逆育种带来革命性的突破。本实验前期,对嗜热自养甲烷杆菌(古菌模式)进行非生物胁迫(高温、高盐)处理后,通过对其蛋白质组学iTRAQ分析筛选出高表达的铁氧还蛋白(ferredoixn,Fd)氨基酸序列。在本文中,我们利用基因合成的方法,获得了水稻中高表达的MtFd基因,进一步,构建了水稻转化载体pCAMBIA1301-Mt Fd,通过农杆菌介导法将其转入水稻ZH11中,分析了MtFd转基因水稻与野生型对照植株,正常生长条件下的光合特性和农艺性状的差异,及盐、高温、和低温胁迫下转基因植株和野生型对照的光合效率。本文主要结果如下:1.MtFd过表达载体的构建及转基因水稻的获得(1)根据嗜热自养甲烷杆菌铁氧还蛋白的氨基酸序列,通过对水稻偏爱密码子分析,重新设计了MtFd DNA序列,交由公司进行基因合成。利用转基因载体pCAMBIA1301,成功构建了水稻转化载体pCAMBIA1301-MtFd。(2)利用农杆菌介导的方法,将pCAMBIA1301-MtFd转化水稻中花11,通过潮霉素筛选和反转录PCR鉴定,获得T_0代MtFd转基因水稻植株18株。通过半定量PCR筛选出表达量较高的三个独立株系(MtFd-1、MtFd-2、MtFd-5)进行加代种植获得T_1代植株。2.正常生长条件下,MtFd转基因水稻植株光合特性的测定在自然气温下、上午9:00-11:00,利用Li-6400便携式光合测定系统对抽穗期水稻剑叶分别测定净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、细胞间隙CO_2浓度(Ci)和蒸腾速率(Tr)。结果表明:与野生型相比,转基因株系Mt Fd-1、MtFd-2、MtFd-5净光合速率(Pn)极显著提高,分别提高51.2%、24.9%和31.2%,其中最大增加了59.97%(MtFd-1-3);而气孔导度与光合作用速率呈现正比例的关系,增加幅度分别为60.5%、21.2%和28.8%;胞间CO_2和蒸腾速率均上升,但是上升的差异不显著。这一结果表明,正常生长条件下,MtFd的异源表达提高了水稻的光合速率。3.MtFd转基因水稻植株株高、粒长、粒宽、千粒重等农艺性状的测量利用生物统计学方法对T_1代表达量较高的三个独立株系(MtFd-1、MtFd-2、Mt Fd-5)进行株高、粒长、粒宽、千粒重等农艺性状的测量。结果显示,与野生型相比,转基因植株的株高、粒宽和千粒重显著下降,而粒长显著增长。转基因株系Mt Fd-1、MtFd-2、MtFd-5株高分别为野生型的86.9%、89.5%和90.4%;粒宽分别为野生型的89.3%、89.5%和91.9%;千粒重分别为野生型的84%、86.4%和90.9%;粒长分别增长了5%、5.9%和10.9%。4.MtFd转基因水稻幼苗在非生物胁迫下光合特性的测定(1)低温胁迫下MtFd转基因水稻幼苗光合特性对生长至六叶期的水稻进行低温(8℃)胁迫,结果表明:在胁迫初期(0~2d)与正常生长条件相比,MtFd转基因株系及野生型水稻的的净光合速率(Pn)极显著下降,ZH11、MtFd-1-2、MtFd-2-3、MtFd-5-1分别为正常生长条件下的11.8%、13.9%、21.9%、12.4%。相比野生型,转基因株系Pn下降更快,且光合速率更低。同时,与野生型相比,转基因株系的气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)和细胞间隙CO_2(Ci)与净光合速率(Pn)的变化趋势一致,均出现明显的下降。在胁迫后期(2~4d)MtFd转基因株系与野生型净光合速率(Pn)略有回升,但不显著。同时,与野生型相比,转基因株系的气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)和细胞间隙CO_2(Ci)与净光合速率(Pn)的变化趋势一致,都略有回升。(2)高温胁迫下MtFd转基因水稻幼苗光合特性对生长至六叶期的水稻进行高温(42℃)胁迫,结果表明:在胁迫初期(0~2d),与正常生长条件相比,MtFd转基因株系及野生型水稻的的净光合速率(Pn)极显著下降,ZH11、Mt Fd-1-2、MtFd-2-3、MtFd-5-1分别为正常生长条件下的60.9%、68.3%、51.9%、59.4%。与野生型相比,转基因株系下降较为迅速,但是Pn始终维持在较高水平。但是Pn下降的同时伴随着Gs和Ci下降和Tr上升。在胁迫后期(2~4d),MtFd转基因株系与野生型净光合速率(Pn)略有回升,但不显著。同时伴随着Gs上升和Ci、Tr的下降,但是与处理第2天相比,变化趋势均不显著。(3)MtFd转基因水稻幼苗盐胁迫下光合特性对生长至六叶期的水稻进行高盐(150 mM)胁迫,结果表明:在胁迫初期(0~2d),与正常生长条件相比,MtFd转基因株系及野生型水稻的的净光合速率(Pn)极显著下降,ZH11、Mt Fd-1-2、MtFd-2-3、MtFd-5-1分别为正常生长条件下的75.4%、65.7%、82.1%和64.9%。与野生型相比,转基因株系下降较为迅速,但是Pn始终维持在较高水平。但是Pn下降的同时伴随着Gs和Ci上升和Tr下降。在胁迫后期(2~4d),MtFd转基因株系与野生型净光合速率(Pn)持续下降,同时伴随着Gs、Ci、Tr的下降。非生物胁迫下,Mt Fd转基因水稻幼苗的光合特性变化趋势虽然与野生型植株相似,但变化响应似乎更为迅速,这提示我们MtFd可能通过影响光合作用来提高植株对逆境胁迫的耐性
【图文】：

电子传递,卡尔文循环,电子,最新研究成果

硫键相互作用，如 AGPase，FBPase，SBPase 等与 Calvin 循环密切相关的酶。在叶中 Fd 主要向 FNR 提供电子用于接下来 NADPH 的还原最后在用于卡尔文循环[70, 71]。而根中恰恰与此相反，Fd 需要 FNR 提供电子，如图 1。图 1 Fd 在根、叶中代谢途径Fig.1 Metabolic pathways of Fd in roots and leaves我们参考 Mulo (2011)文献和浙江大学杨超等人最新研究成果[72, 73]，来总结植物 Fd 在参与不同电子的调控途径并对蛋白结构、功能等进行探讨，，如图 2。

代谢途径,电子

第 1 章前言生驱动 ATP 的 DpH 梯度通过 ATP 合成酶合成。在电子传输中链，PSI 将给予[2Fe-2S]结构 Fd[68]。电子通过光系统传输产生减少的 Fd。Fd 降低可一步与酶铁氧还蛋白：硫氧还蛋白还原酶（FTR）相互作用并被氧化成氧化，而硫氧还蛋白（Trx）减少[69]。只要 Trx 减少，它就会与目标酶上的特定二相互作用，如 AGPase，FBPase，SBPase 等与 Calvin 循环密切相关的酶。中 Fd 主要向 FNR 提供电子用于接下来 NADPH 的还原最后在用于卡尔文[70, 71]。而根中恰恰与此相反，Fd 需要 FNR 提供电子，如图 1。
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S511

【参考文献】