家蚕核型多角体病毒orf61基因缺失对病毒复制和各时期基因转录的影响

发布时间：2020-05-17 15:27

【摘要】：orf61是杆状病毒晚期表达的核心基因之一。为了研究家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)orf61基因的功能,利用Red重组技术与Bac-to-Bac系统分别敲除和异位补回orf61基因,构建了orf61缺失型病毒orf61-ko-Bacmid以及补回型病毒orf61-reBacmid,然后分别转染家蚕培养细胞Bm N,调查orf61基因缺失对Bm NPV复制和不同时期基因转录的影响。检测orf61基因缺失型病毒转染Bm N细胞液上清中的病毒滴度为0,说明orf61基因缺失导致病毒不能形成有感染活性的芽生型病毒粒子(BV);荧光定量PCR分析orf61基因缺失会显著地降低病毒基因组的复制水平,进而导致病毒各个时期基因转录水平极显著下降(P0.01)。此外,通过体外EMSA试验和构建双荧光素酶报告基因系统,检测ORF61蛋白对多角体蛋白基因polh启动子的调控作用,结果显示该蛋白质是polh基因转录的负调节因子。研究结果有助于深入阐释Bm NPV orf61基因在病毒基因组复制中的作用以及对极晚期表达的多角体蛋白基因polh的转录调控作用。
【图文】：

的上、下游引物分别为OＲF61F和OＲF61Ｒ，cat基因扩增的上、下游引物分别为catF和catＲ。用于重组基因扩增的引物组合分别为OＲF61F和OＲF61Ｒ、OＲF61F和catＲ、catF和OＲF61Ｒ。引物序列见表1。1.3.2orf61补回型Bacmid的构建根据orf61基因序列设计补回引物OＲF61reF和OＲF61reＲ，上游引物引入XhoⅠ酶切位点，下游引物引入KpnⅠ酶切位点，，PCＲ产物包含orf61基因上游启动子序列共242bp。然后把扩增的序列插入转移载体pFast-Bac-HTB中，并利用Bac-to-Bac系统将序列转座至Bacmid，获得补回型Bacmid，鉴定方法同上。图1orf61基因缺失型BmNPV病毒(A)和orf61基因补回型BmNPV病毒(B)的构建策略示意图Fig.1Schematicstrategyforconstructionoforf61knockoutBmNPVbacmid(A)andorf61rescuedBmNPVbacmid(B)

源蛋白的序列相似度分别为96%、91%、68%和54%(图2-B)。利用最大简约法构建的OＲF61蛋白序列系统发育树显示，BmNPV与AcM-NPV的亲源关系较近，而与DekiNPV的亲缘关系较远(图2-C)。B图阴影示比对序列中的氨基酸残基完全一致。Ⅰ—BmNPVOＲF61(NP_047478．1)，Ⅱ—AcMNPVOＲF75(NP_054105．1)，Ⅲ—MaviNPVOＲF58(YP_950788．1)，Ⅳ—ThorMNPVHypothetical(YP_007250482．1)，Ⅴ—CapoNPVOＲF6(YP_009255324．1)，Ⅵ—DekiNPVOＲF79(AFS51957．1)。BackgroundinpanelBindicateidenticalaminoacidresiduesinalignedsequences．图2BmNPVOＲF61的保守结构域(A)及与其他病毒同源蛋白的氨基酸序列比对(B)和系统进化分析(C)Fig.2ConservativestructuraldomainofBmNPVOＲF61(A)，alignmentofaminoacidsequencesofOＲF61andhomologousproteinsfromotherviruses(B)andphylogeneticanalysis(C)

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本文编号：2668774