橡胶树花药愈伤组织遗传转化受体系统的优化及橡胶树HbCERK1基因的转化

发布时间：2020-05-19 12:48

【摘要】：巴西橡胶树是天然橡胶的主要来源,并且是我国的战略性物资,但我国天然橡胶自给率仅约为18%,提高橡胶产量是缓解我国天然橡胶供需矛盾的有效途径。病害导致橡胶产量每年损失10～30%,是制约天然橡胶安全生产的主要因素之一。当前的栽培措施与农药防治橡胶树病害的能力有限,且长期大量使用农药,对橡胶林土壤肥力保持、生态环境和人畜的安全都构成很大威胁,故培育抗病高产品种成为我国乃至全世界产胶国家的橡胶树育种的有效途径。橡胶树因本身为热带高大乔木,操作不易、遗传上高度杂合、育种周期长且环节多等多种因素影响,利用常规育种进行品种改良进展缓慢,转基因技术的应用与抗病相关基因的克隆为橡胶树分子抗病育种提供了新的途径。遗传转化效率低是我国橡胶树功能基因研究和抗病分子育种的瓶颈,优良的遗传转化受体系统是提高橡胶树植物再生和遗传转化效率的重要环节和前期基础。本试验利用热研7-33-97品种的橡胶树花药为外植体,通过花粉发育时期检测;胚性愈伤组织的诱导、甄别和增殖等环节来优化橡胶树花药愈伤组织,提高体细胞胚的分化、成熟和植株再生。创建了优化胚性愈伤组织的保存方法,降低因频繁继代造成的愈伤组织胚性丧失和人工劳作的繁琐。利用优化的花药胚性愈伤组织作为遗传转化受体,以根癌农杆菌为介导,GUS、GFP为报告基因,建立和优化了橡胶树花药体细胞胚性愈伤组织的遗传转化体系,并利用该体系转化橡胶树HbCERK1基因。主要结果如下:1、热研7-33-97橡胶树品种雄花蕾纵径约2.81～3.20 mm时,花粉粒发育多为单核靠边期,是诱导易碎爽脆型花药脱分化愈伤组织的适宜外植体;雄花蕾纵径是筛选外植体的适宜指标。2、单粒花药接种是诱导橡胶树易碎爽脆型花药脱分化愈伤组织的适宜接种方式,比雄花整枚单体雄蕊接种方式的诱导率显著提高了 60.6%。3、小球状、易碎爽脆、颜色嫩黄是橡胶树花药胚性愈伤组织的典型特征,可借助解剖镜进行甄别,提高胚性愈伤组织的识别和利用效率。4、辅以花药子叶形体细胞胚看护哺育甄选胚性愈伤组织,在体胚萌发培养基上进行增殖培养,是胚性愈伤组织快速增殖的适宜方式,增殖速率比正常增殖显著增加2.9倍。5、优化的花药胚性愈伤组织的体细胞胚诱导分化率比花药脱分化愈伤组织显著提高2.04倍,体细胞胚总数和正常子叶胚数分别显著增加了 69.2%和168.0%,植株再生率也显著增加了 2.7倍。6、低温冷藏胚性愈伤组织的相对生长量比对照的显著降低83.1%,但细胞活力相对强;低温冷藏胚性愈伤组织的SOD、POD、CAT和APX等抗氧化酶活性与对照无显著差异,但GR酶活性比对照的显著增加4.21倍;恢复(25±2)℃、正常增殖培养,胚性愈伤组织的存活率、相对生长量、体细胞胚诱导率与对照的无显著差异,但植株再生能力提高47.2%。7、优化的花药胚性愈伤组织是橡胶树良好的遗传转化受体,以GUS、GFP为报告基因,建立了橡胶树花药胚性愈伤组织的遗传转化体系:以花药胚性愈伤组织为转化受体,通过无钙离子培养基预培养10 d,菌液侵染浓度OD600为0.6～1.0,侵染时间为20～40 min,暗培养共培养3 d,乙酰丁香酮(AS)浓度为100μM,其遗传转化率大于5%。8、利用建立的花药胚性愈伤组织遗传转化体系转化橡胶树PTI先天免疫途径基因HbCERK1,通过PCR、RT-PCR以及western blot等方法检测,确定外源基因HbCERK1成功导入整合到橡胶基因组DNA中。本研究优化了橡胶树花药胚性愈伤组织的诱导、增殖和保存,为今后适时提供橡胶树遗传转化受体材料提供理论依据和方法;建立了稳定的花药胚性愈伤组织遗传转化体系,为完善橡胶树高效、稳定的遗传转化体系奠定基础;转橡胶树HbCERK1的转基因株系经过扩繁和移栽,可为后期进行橡胶树HbCERK1基因功能研究提供研究材料。
【图文】：

期、花药生理状态等密切相关。逡逑将ｉ、ｉｉ和ｉｉｉ三组雄花以整枚花蕾的单体花药剥离下接种到脱分化愈伤组织诱逡逑导培养基上，培养４５邋ｄ后，如图４所示，所诱导出的愈伤组织主要有三种类型，逡逑第一种为爽脆、颜色嫩黄的易碎类胚性愈伤组织，此类愈伤组织进一步诱导可形逡逑成胚性愈伤组织，后期分化体细胞胚状体机率较高；第二种为松散、水浸状褐色逡逑２４逡逑

源基因的优良受体。前期易碎爽脆型的脱分化愈伤组织诱导，是后期胚性愈伤组逡逑织形成的首要环节和重要基础。在合适的调控培养基和培养方式下，与接种方式逡逑密切相关。如图６所示，以ｉｉ组雄花（纵径２．８１？３．２０邋ｍｍ，花粉发育时期主要逡逑为单核靠边期）为外植体，分别以去掉花萼的整枚单体雄蕊（单体雄蕊）与剥离逡逑下单体雄蕊上的单粒花药（单粒花药）的接种方式接种到愈伤组织脱分化诱导培逡逑养基中，，２５邋ｄ后，如图７所示，以ｉｉ组雄花作为外植体来诱导花药脱分化愈伤组逡逑织，以单体雄蕊和单粒花药接种，所诱导出的脱分化愈伤组织皆以鲜黄易碎爽脆逡逑型愈伤组织＆主
【学位授予单位】：海南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S794.1

【参考文献】

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本文编号：2670912