与黄瓜株型性状相关的两个候选基因（长下胚轴CsNABP和圆叶CsPID）的功能初步分析

发布时间：2020-05-20 11:02

【摘要】：株型与作物的品质和产量密切相关,株型育种是作物育种的重要方向,而下胚轴的长度及叶型均是黄瓜株型构成的重要因素,对其调控基因进行研究,对于黄瓜理想株型的构建和株型改良具有重要意义。课题组通过前期的基因精细定位,获得两个与黄瓜株型性状CsLH1(LONG HYPOCOTYL 1)和CsRL(ROUND LEAF)相关的候选基因,分别为控制黄瓜下胚轴伸长的候选基因CsNABP(Nucleic Acid-Binding Protein)和圆叶基因CsPID(PINOID)。本研究对这两个候选基因分别进行了克隆并构建了相应的表达载体,通过农杆菌遗传转化初步验证这两个基因的功能。主要结果如下:1.CsNABP过表达载体和基因敲除载体的构建及在黄瓜中的遗传转化利用CRISPR/Cas9技术分别构建了CsNABP基因起始位点和核心功能区的敲除表达载体sgRNA1-Cas9-CsNABP和sgRNA2-Cas9-CsNABP;通过农杆菌介导CsNABP基因敲除载体对黄瓜进行了遗传转化,经PCR检测,获得9株转sgRNA1-Cas9-CsNABP阳性株和2株转sgRNA2-Cas9-CsNABP阳性株,初步推断在CsNABP基因起始位点和核心功能区敲除载体的阳性转化率分别为1.7%和0.95%。运用同源重组法构建了35S-CsNABP表达载体,经测序、核苷酸序列比对发现,CsNABP存在多个可变剪切体,故未对35S-CsNABP表达载体进行黄瓜遗传转化。2.CsPID基因调控的黄瓜圆叶突变体形态和光合特性分析黄瓜圆叶突变体C949的株高、茎粗等形态指标均显著低于野生型,说明CsPID基因不仅控制了黄瓜的叶型,也影响了黄瓜其它器官的生长发育。在光合特性方面,突变体的叶绿素含量和净光合速率显著高于野生型。3.CsPID基因启动子的功能缺失分析以黄瓜圆叶突变体DNA为模板,克隆不同长度的CsPID基因的启动子序列,通过同源重组法构建相应的植物表达载体。将携带启动子的农杆菌注射烟草叶片,经GUS基因瞬时表达验证启动子活性,结果表明,195bp以上的启动子均具有活性;将不同长度的启动子表达载体转化拟南芥,启动子活性验证结果与在烟草中的结果相符;对T_1代拟南芥阳性株进行GUS染色,结果显示CsPID启动子主要在拟南芥植株的根系、叶片、花絮和种荚等组织中表达。4.CsPID过表达载体和基因敲除载体的构建及在黄瓜和拟南芥中的遗传转化以黄瓜CCMC的DNA为模板,扩增CsPID基因的CDS序列,用同源重组法构建了35S-CsPID过表达载体并进行黄瓜遗传转化,经PCR检测获得了22株35S-CsPID阳性株,T_0代35S-CsPID的阳性转化率为3.4%;利用CRISPR/Cas9技术构建了CsPID基因敲除载体,经PCR检测获得11株sgRNA-Cas9-CsPID阳性株,对这些阳性转基因株进行测序,结果表明,在靶序列附近无突变产生。将35S-CsPID过表达载体转化拟南芥,T_2代阳性转基因株出现侧生初级花序增多,莲座叶簇生且叶片变小等表型,与拟南芥中过表达AtPID(拟南芥PID)基因的表型具有部分相似性,这为证实CsPID基因是控制黄瓜圆叶基因Csrl的候选基因提供了有力的证据。
【图文】：

黄瓜总RNA琼脂糖凝胶电泳检测Fig2-1ThedetectionofRNAinCucumissativusL.

cDNA 为模板，利用位于2000bp上方，，与增成功。20001000750500250100M 1 黄瓜总 RNA 琼脂糖凝e detection of RNA in Cuer；1：黄瓜 RNA M: DM 1
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S642.2

【参考文献】

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本文编号：2672522