香菇木质纤维素酶基因表达相关HMG-box转录因子lelcrp1功能分析

发布时间：2020-05-20 13:53

【摘要】：香菇(Lentinula edodes(Berk.)Pegler)是一种重要的白腐型真菌,主要通过分泌到胞外的木质纤维素酶,以水解酶机制和氧化酶机制降解木质纤维素。由于真菌木质纤维素酶活与相应酶基因的表达具有一致性,因而提高真菌胞外木质纤维素降解相关酶基因表达水平对促进基质有效利用具有重要意义。真菌木质纤维素酶基因的表达受多种转录因子调控,但目前仅有少数白腐型真菌相关转录因子被报道。本课题组前期研究结果显示,一个内源性HMG-box转录因子LELCRP1蛋白(Lentinula edodes Lignocellulase Genes Regulation Protein 1)可能与香菇异核体菌株“武香一号”W1木质纤维素降解相关酶基因的表达有关。本研究以香菇三磷酸甘油醛脱氢酶基因(legpdh)启动子表达潮霉素抗性基因的p CAMBIA1300-g为载体骨架,通过double-joint法连接legpdh启动子及lelcrp1基因反义链片段,采用同源重组法连接片段与线性化载体,构建目标基因RNAi载体;采用根癌农杆菌介导转化法转化香菇异核体菌株W1菌丝,筛选得到4个沉默转化子,其目标基因表达量分别下降至出发菌株的12.6%、16.5%、15.3%和16.2%。采用荧光定量PCR,对RNAi转化子的27个木质纤维素降解相关酶基因表达水平进行分析,发现其中9个纤维素酶基因、1个半纤维素酶基因、2个辅助酶AA9基因和1个锰过氧化物酶基因在基因表达水平上均表现出明显的下调。Southern杂交和TAIL-PCR分析,证明以上13个下调表达的木质纤维素酶基因与lelcrp1基因的转录调控有关。在纤维素+木质素磺酸钠(SLS)培养基中检测香菇菌丝胞外酶活性,发现RNAi转化子的滤纸纤维素酶(FPA)、纤维二糖水解酶(p NPCase)和锰过氧化物酶(Mn P)活性较W1显著降低,其它酶的活性则无明显变化,表明LELCRP1蛋白主要影响香菇纤维素酶和木质素降解酶活性。在不同碳源基质下的香菇菌丝生长试验表明,RNAi转化子在较单一的碳源培养基中,菌丝生长速度与出发菌株W1相比具有显著性差异,且显著慢于出发菌株,但在复杂的碳源基质中生长速度差异并不明显。以上试验结果表明,香菇内源性HMG-box结构域的转录因子LELCRP1能够调控部分木质纤维素酶基因表达和相关酶的酶活性,并且影响香菇菌丝对某些碳源基质的利用。本文为进一步深入研究香菇木质纤维素降解酶基因表达调控的分子机制和调控网络,提高香菇木质纤维素类基质转化利用效率,奠定了初步的基础,具有重要的科学意义。
【图文】：

图谱,香菇,载体质粒

-F GCACAATTACACCGACACGC-R AAGTATCCGAGCCGAACGAG-F CTGGACGACCGAATGCTACTG-R CTGCGAGTCGAAAGTGAAGGG-F CAGCGTGTTCTGATGTCTTGAT-R AGGAAATGACGAGGAAGCGA-F ATCCGACCAGGAACTTGAACC-R GCAGTAACCACGAGATTGAGG-F AACACTGAGAATCCCATAAAG-R GCCATCACAGTAGCGAGACCA-F GCATCCCTTCCACCTCCAT-R CGGGCACAACTCAGTCCAG-F GAGGAACTCACGAGGAAACA-R TGATTATTGGCTACGATGAACA TGGATTGCGTGGAGCCTTTG TCGGGACAGTACCGCTTTGG表 A/C/G/T。, N representsA/C/G/T.

氨基酸序列,香菇,结构域,蛋白

后者具有 HMG-box 型转录因子典型的 DNA-binding 区域（图3-1）。在 NCBI 上通过 CDS 翻译的氨基酸序列对 LELCRP1 蛋白进行同源性比对分析，发现该蛋白与 Repressor ROX1 (L. edodes)的蛋白匹配率高达 99%，而且很早就与其它物种的蛋白分离，说明香菇 LELCRP1 和其它物种的 HMG-box 蛋白的同源性差异较大，是一种比较独特的 HMG-box 蛋白（图 3-2，附录Ⅲ）。图 3-1 香菇 LELCRP1 蛋白功能结构域Fig 3-1 Functional motif of LELCRP1 in L. edodes图 3-2 香菇 LELCRP1 蛋白同源性分析Fig 3-2 Homologous analysis of LELCRP1 in L. edodes
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S646.12

【参考文献】