保加利亚乳杆菌盐胁迫响应基因对菌体分裂增殖的影响

发布时间：2020-05-22 18:17

【摘要】：保加利亚乳杆菌是乳酸菌发酵剂主体菌株,其在高密度培养过程中会受到由于流加碱法抑制酸而产生的盐胁迫。前期研究表明外源添加甜菜碱可有效地缓解菌体所受到的胁迫压力,但是这种方法不能使菌体恢复正常状态,分析其主要原因是在盐胁迫条件下,菌体分裂增殖受到影响。目前,以保加利亚乳杆菌应答盐胁迫引起自身分裂增殖受到影响为切入点的研究很少,因此本课题以保加利亚乳杆菌为研究对象,分析盐胁迫响应基因的差异表达水平并构建突变株,进一步分析相关基因在菌体分裂增殖过程中起到的作用,为保加利亚乳杆菌分裂增殖机理的深入研究奠定一定的理论基础。本文采用荧光定量PCR手段对信号响应因子和膜转运蛋白等可能对盐胁迫产生应答的基因进行了相对mRNA表达量分析。研究发现,在盐胁迫条件下,来自L.bulgaricus 34.5的6个信号响应因子rr1-rr6基因的表达量均有提高,外源添加甜菜碱使这些基因的表达水平下调。分析5个膜转运基因的表达量发现,L.bulgaricus34.5主要通过调控初级转运体基因的表达来响应盐胁迫压力。其中,膜转运体基因feoA在盐胁迫条件下表达量上调了3.59倍,添加甜菜碱后,表达量仍上调了2.65倍。为研究feoA基因对保加利亚乳杆菌分裂增殖的影响,本实验构建了基因敲除表达载体p UC19-F-t,利用同源重组技术,以tet基因为抗性筛选标记,敲除L.bulgaricus 34.5的feoA基因,并从生长曲线、菌体形态变化和分裂相关基因的差异表达水平等多个方面对feoA基因与菌体生长、分裂增殖的关系进行了初步探讨。研究发现,基因feoA的缺失导致L.bulgaricus 34.5的迟滞期被延长了1.5 h,菌体的生物量在生长对数后期下降了15%,稳定期时,恢复到野生株的同期水平。显微观察发现,突变体△feoA菌株在对数生长期呈现出不规则的弯曲或半圆形的菌体形态,稳定期则呈现典型的乳酸菌的密集短杆状形态。通过比较分裂相关基因的表达水平发现,L.bulgaricus 34.5野生型菌株在对数期会显著地提高基因ftsZ、mbl和mreB的表达水平以适应菌体的高速分裂增殖状态。基因feoA的缺失使ftsZ和mreB的表达与野生型相比产生一定的差异,在分裂趋于缓慢的生长对数后期,这两种基因的表达量分别下降了0.61倍和0.31倍。推断基因feoA的缺失能够通过影响ftsZ和mreB的表达而影响菌体自身的分裂增殖,这种影响体现在突变体△feoA菌株在对数期生长量下降,形态异变,但是稳定期的菌体不再受到明显影响。
【图文】：

技术路线图,技术路线

哈尔滨工业大学工学硕士学位论文bulgaricus 34.5 菌体的生长造成了一定的影响；其次，对菌株的表型进行显微观察，通过对比野生型与突变型的形态来判断目的基因的缺失是否对菌体形态有影响，使分裂受阻；最后，采用实时荧光定量 PCR 方法检测分裂相关基因 ftsZ、mreB 和mbl 的表达水平，分析目的基因的缺失是否在转录水平上对分裂关键基因的表达产生了影响，从而影响到菌株进一步的分裂增殖。1.6 技术路线本课题技术路线如下图 1-1 所示。

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本研究所使用的菌株是分离自内蒙古传统发酵乳制品中的德式乳杆菌保加利亚亚种 Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus 34.5，前期实验已证实这是一株盐敏感菌株，其亚致死盐浓度为 0.2 mol/L NaCl，最佳外源甜菜碱（GB）添加浓度为1.2 mmol/L GB。2.1.3.2 大肠杆菌本研究中用于 DNA 克隆的大肠杆菌感受态细胞是 Escherichia Coli DH 5α，购自宝日医生物技术有限公司。2.1.3.3 质粒（1）本研究使用的抗性基因由质粒 pBR322 提供。pBR322 质粒具有四环素抗性，通过 PCR 扩增获得该质粒上的四环素抗性基因。购自北京索莱宝生物科技有限公司。（2）本研究所使用的敲除质粒是 pUC19，该质粒为氨苄青霉素抗性，长度为2686 bp，具有编码 lacZ 蛋白氨基末端的部分序列，在大肠杆菌感受态细胞 E. ColiDH 5α 中可以表现出 α-互补现象，，从而通过蓝白斑筛选，获得重组克隆子。购自宝日医生物技术有限公司。
【学位授予单位】：哈尔滨工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TS201.3

【参考文献】