小麦MATE转运蛋白基因的克隆及功能研究

发布时间：2020-05-22 19:47

【摘要】：多药物及有毒化合物外排转运家族(Multidrug And Toxic Compound Extrusion Family,MATE)蛋白是五类外排转运家族蛋白之一,在各种生物体中起着重要作用。近年来,模式植物拟南芥中MATE家族蛋白研究也逐渐增多,但目前尚无小麦中该类蛋白研究的报道。本研究以一个小麦MATE家族转运蛋白AK336065为研究对象,通过生物信息学、分子生物学、遗传学、细胞生物学等方法对其进行克隆和功能研究。获得以下实验结果:(1)构建小麦、人、酵母、拟南芥MATE家族转运蛋白的系统进化树,发现它们之间具有较高的同源性。(2)通过将AK336065蛋白与已报道的古细菌PfMATE蛋白进行同源性序列比对,结果显示二者具有较高同源性。根据PfMATE蛋白12个跨膜域的位置,预测了AK336065蛋白的12个跨膜域。通过蛋白亚细胞定位实验,发现AK336065蛋白与晚期内体的定位蛋白ARA7有大部分信号重合,表明AK336065蛋白主要定位于晚期内体,推测AK336065蛋白可能参与细胞内体介导的生物学过程。(3)通过构建二元载体,并通过农杆菌介导遗传转化,获得AK336065过表达转基因植株系。AK336065基因过表达导致野生型拟南芥开花时间提前、叶片衰老加剧、莲座叶矮化丛生等。在碳饥饿诱导植物衰老体系实验中发现,AK336065基因促进植物叶片衰老,表明AK336065基因参与了叶片衰老调控,是衰老的正调控因子。(4)发现AK336065过表达转基因植株表型与实验室研究的abs3-1D突变体表型较一致,而且根据进化分析,AK336065与ABS3、ABS4、ABS3L1、ABS3L2属同一进化分支,猜测它们彼此的功能具有相似性。通过将AK336065基因在mateq突变体中过表达,发现其可以将mateq突变体表型回复至类似于abs3-1D突变体表型。表明AK336065与ABS3及其同源基因功能相似。(5)小麦AK336065蛋白可能作为一种自噬受体与小麦ATG8自噬家族蛋白具有保守的特异性相互作用。构建BiFC载体通过原生质体表达,发现AK336065蛋白与TaATG8d蛋白存在物理互作。通过预测AK336065蛋白AIM区、丙氨酸取代实验及双分子荧光互补实验来验证这两个蛋白互作发生的特异性。实验发现将AK336065蛋白中预测的两个AIM1、AIM2定点突变后,AK336065~(AIM1+AIM2)与TaATG8d蛋白互作受到明显抑制。表明AK336065蛋白的AIM1、AIM2在与TaATG8d蛋白特异性互作中起重要作用。
【图文】：

图 2-1AK336065 与人、酵母、拟南芥 MATE 蛋白家族进化树ig 2-1 Phylogenetic tree of AK336065 and Human, Yeast, and Arabidopsis MAtransporter family6065 在人、酵母、拟南芥 MATE 家族蛋白中的进化位置；蓝框为酵母 YD、小麦 MATE 家族蛋白中的进化位置；绿框为人 hMATE1、hMATE2 在酵小麦 MATE 家族蛋白中的进化位置，比例尺代表氨基酸替换率me circle was the phylogenetic position of AK336065 in the human, yeast andin family; The blue frame circle was the phylogenetic position of yeast YDR33, Arabidopsis and wheat MATE protein family; The green frame circle was the uman hMATE1、hMATE2 in the yeast, Arabidopsis and wheat MATE protein scale showed amino acid replacement rates. MATE 蛋白同源性比对列比对软件，输出结果相同区域和相似区域分别用黑色和灰色阴对结果可以看出 AK336065 与 PfMATE 相似度较高，并根白的 12 个跨膜结构域来推测 AK336065 的可能跨膜结构域（图

图 2-2AK336065 与 PfMATE 蛋白同源性比对及跨膜结构域预测Fig 2-2 Homologous alignment result of AK336065 with PfMATE protein and theresult of transmembrane domains prediction.2 小麦 MATE 蛋白的亚细胞定位将 P35S::AK336065-GFP 融 合 表 达 载 体 与 晚 期 内 体 定 位 融 合 载5S::mScarlet-ARA7 共同转化原生质体。结果显示：AK336065-GFP 呈现离散的点信号（图 2-3）；AK336065-GFP 与 mScarlet-ARA7 有大部分信号重合（图 2-3）。蛋白定位于细胞的晚期内体，可能参与了细胞内体循环系统运输过程。图 2-3AK336065 在拟南芥叶肉细胞中的亚细胞定位Fig 2-3 Subcellular localization of AK336065 in Arabidopsis mesophyll cells
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q943.2

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本文编号：2676510