谷子O-乙酰丝氨酸（硫醇）裂解酶家族基因的克隆与功能分析

发布时间：2020-05-22 22:47

【摘要】：O-乙酰丝氨酸(硫醇)裂解酶(OASTL)是一类在硫元素同化代谢中具有重要作用的酶类,在半胱氨酸合成的最后一步起着关键的催化作用。近年来,植物中OASTL的功能逐渐被解析,除了半胱氨酸合成酶之外,它们还在硫代半胱氨酸的合成,硫化氢的生成以及去氰毒过程中起作用。目前在植物中,仅在拟南芥中有关于这一类酶的详细报道,此外,在番茄和油菜等双子叶植物中也有对个别OASTL家族成员的功能研究,但是在单子叶植物中几乎未见对OASTL家族基因功能的报道。谷子是一种具有抗旱性、强适应性以及高光效的谷类作物,被视为极具有潜力的单子叶模式植物。因此,本研究以晋谷21号(Setaria italica)为材料,通过分子生物学,生物信息学和生理生化等技术方法对谷子OASTL家族三个蛋白的功能进行多层次的研究分析,为更深入了解谷子OASTL家族其它蛋白以及单子叶植物OASTL蛋白的功能与作用机制提供理论基础。下面是本文的主要实验结果:1.基因克隆和序列分析:通过PCR技术获得三个谷子OASTL家族基因的编码序列,并分别命名为Si-OASTL7、Si-OASTL9和Si-OASTL10。通过生物信息学的方法对三个基因进行分析比较,结果显示,Si-OASTL7、Si-OASTL9和Si-OASTL10的编码区长度分别为807 bp、858bp和855 bp;编码蛋白长度分别为268、285、284个氨基酸。通过序列同源比对和系统进化分析,发现谷子具有OASTL蛋白家族成员的保守序列,但在进化上,它们同拟南芥等双子叶植物OASTL蛋白亲缘关系较远,相反它们存在于一个特异于单子叶植物的OASTL蛋白亚支。2.谷子OASTL蛋白的体外表达:用限制性内切酶将载体pMD-18T-SiOASTL7、pMD-18T-SiOASTL9和pMD-18T-SiOASTL10酶切,并将产物重组到p-Cold表达载体,之后转化大肠杆菌DH5α,得到重组载体p-Cold-SiOASTL7、p-Cold-SiOASTL9和p-Cold-SiOASTL10,进一步通过菌液PCR和双酶切鉴定证明重组载体构建成功,然后将3个重组质粒转化进表达菌株BL21(DE3)中。将以上构建好的三个表达载体用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导,确定最终的诱导条件为0.2 mmol/L的IPTG、16℃条件下过夜诱导。通过Ni柱亲和层析纯化得到Si-OASTL7、Si-OASTL9和Si-OASTL10的体外表达蛋白。杂蛋白与目的蛋白的最佳洗脱浓度分别是200mmol/L和500 mmol/L。3.蛋白酶活分析:对纯化所得到的三个蛋白进行酶活分析,实验结果表明:在Si-OASTL7、Si-OASTL9和Si-OASTL10这三个蛋白中,只有Si-OASTL9同时具有催化半胱氨酸和硫代半胱氨酸合成的能力,而Si-OASTL7和Si-OASTL10在生成H_2S、半胱氨酸以及硫代半胱氨酸的过程中均没有活性。4.三个基因的表达模式分析:通过qRT-PCR检测了Si-OASTL7、Si-OASTL9和Si-OASTL10在谷子各个器官组织中的表达水平,以及高盐、干旱和重金属镉(Cd)胁迫处理后三个基因的表达水平变化。结果显示,在谷子的各个组织器官中三个基因均有表达,其中叶片中表达水平最高;在干旱和高盐的胁迫条件下,三个基因的表达量均有显著的升高,并在处理9h时表达水平达到最高;但在Cd胁迫处理下,只有Si-OASTL9的表达水平显著上调,另外两个基因没有变化。综上所述,本实验通过生物信息学手段对谷子OASTL家族基因进行了初步分析,完成了三个Si-OASTL基因的克隆与原核表达载体的构建,并进行了蛋白的体外表达,纯化与酶活分析;此外,还分析了这3个Si-OASTL基因在植株生长发育的不同组织和胁迫条件下表达水平的变化,为谷子中OASTL家族蛋白功能的进一步分析奠定了基础。
【图文】：

硫元素

植物硫的吸收过程硫（Sulfur，S）作为大量元素之一，参与植物的生长过程，在植物干重中所 0.1%-1%[1, 2, 3]。在高等植物中硫的主要来源是植物从根部吸收硫酸盐，另外可以吸收地上部分的气体硫[4]。一般情况下，在植物中无机硫变为有机硫的途过根部吸收的硫酸盐还原反应生成两种重要的含硫氨基酸：蛋氨酸（Met）与酸（Cys）[5]。在植物的生长和适应环境过程中也有其它的含硫化合物参与[6]物生长过程中，适度施加硫肥可以改善植物生长状况和质量[7]。因此，硫的含物生长和发育过程中起重要作用[8]。植物吸收硫属于主动吸收的过程，主要途径是植物根部从土壤中吸收 SO42-，程在硫转运体（sulfate transporter ST）的协助下完成[9]。此外，半胱氨酸的合在线粒体中，同样也在质体和胞质中合成。但是在硫同化途径中硫还原部分在质体中。从土壤中吸收 SO42-到合成 Cys 是一个较为复杂的过程，涉及到多下图为形成半胱氨酸的具体机制：

晋谷21号,幼苗,谷子

多样的家族蛋白，而谷子不仅仅4]，但是关于该家族基因在谷子了三个 OASTL 家族基因，，通过生物信息学的方法对 S质，高级结构以及同源性做了，源于山西省农业科学院谷子研后的幼苗。种子消毒方法：先用ClO 消毒 10 min 左右，之后用蒸上铺四层纱布，最后将适量种子为 25℃，光照强度为 160 μE·苗生长 5 d 之后，每天需更换 1
【学位授予单位】：山西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S515

【参考文献】