杏果实两个类胡萝卜素裂解双加氧酶基因及其启动子的克隆与功能分析

发布时间：2020-05-22 21:59

【摘要】：杏(Prunus armeniaca L.)是重要的蔷薇科(Rosaceae)果树,其果实色泽艳丽、风味独特、营养丰富,在果品市场上颇受消费者喜爱。新疆杏作为独特的生态品种群,有白色、黄色、橙色和红色等众多变异类型,其底色主要受类胡萝卜素积累的影响。课题组前期研究发现,类胡萝卜素裂解双加氧酶基因(CCD)在杏果实呈色和特征香气成分芳香味脱辅基类胡萝卜素的形成中扮有重要作用,但其具体作用和机制尚不明确。本研究在前期转录组挖掘得到的两个CCDs的基础上,以不同色泽类型的新疆杏果实为材料,采用高效液相色谱(HPLC)和气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)检测分析果实成熟过程中类胡萝卜素和芳香味脱辅基类胡萝卜素的组成和含量变化,通过基因表达模式分析、基因克隆、亚细胞定位、生物信息学分析和启动子缺失等方法鉴定分析PaCCD1和PaCCD4在杏果实类胡萝卜素代谢中的作用。主要研究结果包括:1.从供试品种的果实中共检测出7种类胡萝卜素,包括:β-胡萝卜素、β-隐黄质、α-胡萝卜素、八氢番茄红素、新黄质、叶黄质和紫黄质。果实发育的完熟期(S5),深色品种(旦杏和红玉杏)主要以积累β-胡萝卜素为主,分别占果皮中类胡萝卜素总量的64.09%和73.32%,同时还含有α-胡萝卜素、β-隐黄质、叶黄质、紫黄质和少量的新黄质,其中,α-胡萝卜素和β-隐黄质为仅在2个深色品种中检测到的物质。浅色品种(轮台小白杏和白杏)中的类胡萝卜素含量显著低于深色品种(P0.05),轮台小白杏主要以积累叶黄质为主,果皮中该物质含量占类胡萝卜素总含量的68.89%,白杏主要以积累叶黄质和β-胡萝卜素为主,分别占果皮类胡萝卜素总量的38.94%和24.87%。果实发育过程中,深色品种中主要类胡萝卜素迅速积累,浅色品种中β-胡萝卜素的含量迅速降低,八氢番茄红素的含量在果实成熟过程中增加。共检测到β-大马酮、β-紫罗兰酮和二氢-β-紫罗兰酮3种具有芳香味的脱辅基类胡萝卜素,其中β-紫罗兰酮的含量最为丰富。果实发育过程中,各品种的果实中芳香味脱辅基类胡萝卜素的含量均显著增加,但浅色品种中β-紫罗兰酮的含量显著高于其在深色品种中的含量(P0.05)。2.采用RACE技术从“轮台小白杏”果实中分别克隆得到PaCCD1和PaCCD4基因的全长序列,这两个基因的ORF分别为1644bp和1812bp,各自编码547和604个氨基酸,预测两个蛋白的分子量分别为61.699和66.021KD,等电点分别为6.16和6.65。系统进化分析表明,两个基因均能与已知功能的相应基因家族成员聚在一起,且与蔷薇科果树桃的同源性最高。蛋白结构分析表明,二者均含有典型的RPE65结构域,符合CCD家族成员的特点。并对两个基因进行了亚细胞定位观察,结果发现PaCCD1定位于细胞质,PaCCD4定位于质体。3.采用实时荧光定量(qPCR)技术对PaCCD1和PaCCD4的时空表达模式分析发现,PaCCD1和PaCCD4在果实中的表达最高,在花中也有表达,在根、茎、叶中基本上不表达,表明两个CCDs为果实中特异表达的基因。整体上,PaCCD1在各个品种前四个发育阶段表达量均上升,与果实中脱辅基类胡萝卜素含量变化趋势一致,表明PaCCD1可能参与裂解杏果实中类胡萝卜素形成芳香味脱辅基类胡萝卜素。PaCCD4基因在浅黄色品种中表达量高于红橙色品种而使其果实颜色表现为浅黄色。红橙色品种由于其表达量较小而使果实的底色黄色变深,表明PaCCD4可能参与调节杏果实中类胡萝卜素的积累。而类胡萝卜素代谢相关基因中PDS、CRTISO和ZEP在果实发育过程中对类胡萝卜素的调控作用影响较小,PSY、LCYB和CHYB对果实中类胡萝卜素的合成均有一定的调控作用。4.为了查找杏果实PaCCD1和PaCCD4基因的上游调控元件,本研究使用基因组步移法,分别克隆了PaCCD1和PaCCD4基因启动子区2233bp和1838bp的序列。顺式作用元件分析发现,两个启动子均含有多个与光、脱落酸、茉莉酸甲酯等与环境因子、激素信号和调控组织表达的顺式作用元件。此外,PaCCD1启动子中含有刺激诱导和热胁迫响应元件,PaCCD4启动子中含有赤霉素、低温和增强转录水平的元件,表明CCDs基因家族在植物体发育过程中能够参与多种生命活动。5.为了确定基因启动子的核心区域,使用启动子缺失实验,构建了5’端启动子缺失片段并瞬时转化烟草进行GUS活性检测,结果表明,随启动子片段的缺失,PaCCD1和PaCCD4的GUS活性逐渐减弱,PaCCD1的启动子核心区域在600bp—2233bp区段内,PaCCD4的启动子核心区域在600bp—1838bp区段内,为进一步筛选转录调控因子奠定了基础。
【图文】：

序列,胡萝卜素,生物合成途径,类胡萝卜素

图 1-1 植物类胡萝卜素的生物合成途径[67]Fig.1-1 Biosynthesis pathway of plant carotenoid萝卜素的裂解解双加氧酶（CCDs）是分解类胡萝卜素多烯链的形成脱辅基类胡萝卜素的关键酶。其共同特点是而，除了四个严格保守的组氨酸残基参与铁与氧氨酸也固定在组氨酸的位置上，类胡萝卜素裂解酸序列是相似的[68]。CCDs 包括类胡萝卜素裂解双胡萝卜素双氧合酶（9- cis - Epoxy carotenoid d中类胡萝卜素裂解酶根据系统发育和基因功能被1, CCD4, CCD7 和 CCD8[69,70]，各个亚家族的功能要通过广泛的裂解位置和底物特异性来产生植物激多种脱辅基类胡萝卜素，从而发挥其生物学功能。CCD 基因已在多种植物中报道，拟南芥中包含 CC中有 5 个 9-顺式双加氧酶，分别是 AtNCE

功能图,脱辅基,底物特异性,裂解产物

图 1-2 CCD 和 NCEDs 的裂解产物脱辅基类胡萝卜素Fig.1-2 The cleavage products of CCD and NCEDs apocarotenoidsNCED 与其它 4 个亚家族成员的同源性很低，，其底物特异性和功能也明NCED 在 11,12 双键位上通过不对称裂解新黄质或紫黄质产生 C15 的产物它能够参与植物激素脱落酸合成的限速步骤[74-76]。NCED 作为 ABA 生物关键酶，已在多种植物中被证明其表达与果实发育和成熟密切相关[77]。Perseaamericana）PaNCED1 和 PaNCED3 能调控果实的成熟[78]；在olanumlycopersicum）中特异性抑制 SlNCED1 基因能延缓果实成熟并延长9]；此外，用烟草脆裂病毒（tobacco rattle virus，TRV）诱导基因沉默技术莓（Fragaria × ananassa）FaNCED1 基因下调会导致 ABA 含量显著降低[A 在植物的果实发育和成熟过程中也起着重要作用，尤其是对非跃变型果实内源 ABA 合成来延缓葡萄成熟[82]，而外源 ABA 对葡萄浆果的着色有促3]。拟南芥中的 5 个 NCED 成员均定位于细胞质中。拟南芥 NCED3 突变胁迫后不能积累 ABA，而 NCED 基因的过表达会导致 ABA 积累和耐旱
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S662.2

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