人GJB6基因突变体的细胞功能学对比研究

发布时间：2020-05-22 21:14

【摘要】：研究背景有汗性外胚叶发育不良(hidrotic ectodermaldysplasia,HED),也被称为Clouston综合征,是一种常染色体显性遗传的以掌跖角化过度、甲营养不良以及毛发缺陷等三联征为特征的遗传性综合征。有汗性外胚叶发育不良的致病基因为编码缝隙连接蛋白30(Cx30)的GJB6基因。至今共发现五种错义突变,分别为G11R、A88V、V37E、D50N和N14S。迄今为止对有汗性外胚叶发育不良这个疾病的发病机制研究比较少,对致病的GJB6基因进行更加深入的探究是很有必要的,希望能取得更进一步的进展。首先运用Tet-on基因表达系统成功构建了 GJB6基因野生型及其突变型A88V的HaCaT细胞的稳定株是本课题组的前期工作,接下来进一步运用构建的G11R突变(功能最强)的HaCaT细胞的稳定株制作出Affymetrix表达谱芯片,研究了GJB6基因可能参与的信号通路及其可能的作用机制,并且通过细胞功能学实验进一步了解了GJB6基因突变引起HaCaT细胞凋亡的机制,对GJB6基因突变体引起有汗性外胚叶发育不良复杂多样的临床表型的可能作用机制进行了初步探讨。本研究中,仍然运用以Tet-on慢病毒转染为载体建立的GJB6基因及其三种突变体(D50N、V37E、A88V)的HaCaT细胞的稳定株,通过四种细胞功能学实验,在不同突变体之间进行细胞功能学对比。目的通过对运用Tet-on基因表达系统成功构建的GJB6三种突变型(D50N、V37E、A88V)及其野生型的HaCaT细胞的稳定株进行四种细胞功能学实验,并且分组比较这些不同的突变体对于细胞增殖、凋亡和衰老功能的影响,更加进一步地对GJB6基因突变体引起有汗性外胚叶发育不良不同临床表型的可能机制进行探究,以便为后续对有汗性外胚叶发育不良进行分型研究提供细胞功能学研究基础。方法本实验使用已成功构建的GJB6基因突变型(D50N、V37E、A88V)和野生型的稳定细胞株,运用MTT法和Brdu法检测GJB6基因突变型和野生型经四环素诱导目的基因表达后对HaCaT细胞增殖功能方面的影响;用Caspase3/7酶活性法检测GJB6基因突变型和野生型经四环素诱导目的基因表达后对HaCaT细胞凋亡功能方面的影响;用SA-β-gal染色法检测GJB6基因突变型和野生型经四环素诱导目的基因表达后对HaCaT细胞衰老功能方面的影响。结果MTT法检测结果:D50N+DOX组细胞增殖抑制率最高,其次为A88V+DOX组,V37E+DOX组细胞增殖抑制率最低。Brdu法检测结果:D50N+DOX组细胞增殖抑制率最高,其次为A88V+DOX组,V37E+DOX组细胞增殖抑制率最低。Caspase3/7酶活性法结果:D50N+DOX组HaCaT细胞凋亡增加,而A88V+DOX组和V37E+DOX组比起WT+DOX组(对照组)和NC+DOX组(空白组)HaCaT细胞呈现凋亡减少的表现。SA-β-gal染色法检测结果:各组中,衰老细胞数量均较少(有些视野未出现衰老细胞),即各组细胞均未发生明显衰老。结论我在前期工作中查阅的文献中报道的人GJB6基因突变型D50N的病例可以说是凤毛麟角,但相较于突变型A88V和V37E具有更大的研究价值。因为D50N突变体在细胞功能学上的特殊性,提示此突变型是否与有汗性外胚叶发育不良的症状的复杂性及某些呈现负向的症状具有一定的相关性,如大部分患者甲板增厚,而极少数患者指甲表现薄而脆并缩短。上述推测是否成立需要实验室构建相关的动物模型进一步验证。
【图文】：

０．０００邋…逡逑ｄａｙ邋３逡逑图２ｆ经过四环素处理的五组ＯＤ４５０／ｆ0ｌｄ的均值绘制出柱状图。更清晰的观察到Ｄ５０Ｎ＋ＤＯＸ逡逑组细胞增殖呈现严重抑制，细胞增殖率甚至已经低于空白组（ＮＣ＋ＤＯＸ）。逡逑３３逡逑

ｄａｙ邋１逦ｄａｙ邋３逡逑图２ｅ经过四环素处理的五组的第一天和第三天的ＯＤ４５０值绘制出柱状图。逡逑１．４００逡逑■ＮＣ＋ＤＯＸ逡逑１．２００邋｜邋逦逡逑逦邋■邋ＷＴ＋ＤＯＸ逡逑１．０００邋Ｔ逡逑０．８００逡逑＿邋Ａ８８Ｖ＋ＤＯＸ逡逑＿Ｖ３７Ｅ＋ＤＯＸ逡逑０．４００逡逑０．２００逡逑０．０００邋…逡逑ｄａｙ邋３逡逑图２ｆ经过四环素处理的五组ＯＤ４５０／ｆ0ｌｄ的均值绘制出柱状图。更清晰的观察到Ｄ５０Ｎ＋ＤＯＸ逡逑组细胞增殖呈现严重抑制，，细胞增殖率甚至已经低于空白组（ＮＣ＋ＤＯＸ）。逡逑３３逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R758.5

【参考文献】

相关期刊论文 前10条

1 姬灿灿;王震英;燕鹏荣;陈楠;吴静;张永飞;宋亚丽;张莉;;GJB6基因突变体过表达慢病毒载体的构建及其在HaCaT细胞中的表达[J];中国麻风皮肤病杂志;2015年01期

2 蒋树娟;黄丹;何蓉;;1例有汗性外胚层发育不良患者的基因突变分析[J];中国医科大学学报;2014年10期

3 吕永梅;王建峰;孙良丹;王静;;有汗性外胚叶发育不良基因突变检测分析[J];中国热带医学;2014年05期

4 TANIA Mousumi;熊志敏;鹿丽娜;刘双琳;夏昆;胡正茂;;一个中国先天性有汗性外胚层发育不良家系的GJB6基因筛查（英文）[J];中南大学学报(医学版);2013年08期

5 刘宁;史惠蓉;吴庆华;江淼;孔祥东;;有汗型外胚层发育不良家系基因突变分析及孕早期产前诊断[J];中华医学遗传学杂志;2013年04期

6 王占想;陈楠;宋亚丽;王震英;郭小璇;张莉;;一残毁性掌跖角化病家系GJB2基因突变研究[J];中华皮肤科杂志;2012年05期

7 陈楠;张锐利;王震英;宋亚丽;李颂;刘雯敏;宋怀东;潘春明;张莉;;基因诊断有汗性外胚层发育不良一家系[J];中华皮肤科杂志;2009年11期

8 陈晓霞;蒲晓英;代U

本文编号：2676619