草莓FvMYB6-like基因的克隆及功能分析

发布时间：2020-05-23 18:12

【摘要】：草莓作为一种重要的时令水果,由于其独特的芳香和极高的营养价值,受到广大消费者喜爱。果实颜色是草莓外观品质评价标准之一,其主要是由花青苷积累导致的。花青苷的合成受到R2R3-MYB等多种转录因子的调控。本研究从二倍体森林草莓(Fragaria vesca)资源‘Ruegen’中分离得到FvMYB6-like基因,构建其过表达载体,并在拟南芥中实现FvMYB6-like基因异位表达,初步揭示FvMYB6-like基因具有调控花青苷合成及生长点分化的作用。主要结果如下:(1)利用RT-PCR技术从森林草莓资源‘Ruegen’中分离获得FvMYB6-like基因编码区,CDS共768 bp,编码255个氨基酸,等电点为8.60,蛋白质分子量为29.22 kD。(2)利用DNAMAN软件对FvMYB6-like及其同源基因的氨基酸序列进行比对,发现N末端含有高度保守的R2R3-MYB结构域,另外在R3结构域中含有bHLH基序;在C末端含有C1和C2结构域,表明FvMYB6-like属于R2R3-MYB家族的第四亚组。(3)将带有FvMYB6-like和GFP基因的质粒在花椰菜花叶病毒(CaMV)组成型启动子35S驱动下,将其导入拟南芥原生质体,在激光共聚焦电子显微镜下观察FvMYB6-like亚细胞定位情况,结果显示FvMYB6-like基因定位在细胞核中,因此该基因编码一个核蛋白。转录活性试验结果显示FvMYB6-like在酵母系统中不具有转录激活活性。(4)在GDR数据库里找到FvMYB6-like基因启动子序列,利用PlantCARE在线软件分析,发现其启动子上含有参与花青苷合成的MYB结合位点(MYBIIG);并在FvMYB10-YW过表达植株果实中检测FvMYB6-like基因的表达量,结果显示FvMYB6-like基因表达量明显上升;组织特性分析结果显示FvMYB6-like基因在叶片、茎和花中表达量相对较高,在根和果实中表达量相对较低;在草莓果实不同发育时期检测FvMYB6-like基因表达结果显示,随着草莓果实逐渐成熟FvMYB6-like基因的表达量呈下降趋势。(5)通过蘸花法将FvMYB6-like基因导入拟南芥,转基因阳性植株表现出叶片颜色较深,对叶绿素和花青苷测定结果显示,叶绿素含量在转基因拟南芥植株中显著下降,花青苷含量显著上升。此外,转基因拟南芥表现出2-3个顶端生长点(Shoot apical meristem;SAM),且顶端生长相关基因表达量上升。
【图文】：

植物,转录因子,蛋白,相互作用

2016）图 1-1 植物 MYB 转录因子的分类螺旋-转角-螺旋；Ⅰ：1R-MYB/MYB-related；Ⅱ: R2R3-MYB；Ⅲ：3R-MYB；ⅣFigure 1-1 Classification of plant MYB transcription factorH: Helix-turn-helix;Ⅰ: 1R-MYB/MYB-related; Ⅱ: R2R3-MYB; Ⅲ: 3R-MYB; Ⅳ:4R录因子的功能录因子可以参与植物的生长、发育、代谢等过程。基因参与多种，蛋白和蛋白之间的互做是调控植物生长的一种主要的方相互作用实现对靶基因的调控（Singh et al.，1998）。例如，MD40 相互作用形成复合体调控植物的次生代谢，同时也能应答子在植物中的作用可以总结为以下几个方面：YB 转录因子调控植物生长发育中的作用，MYB 转录因子参发育，在根、茎、叶、花、果中均有表达。有研究发现，拟南芥中

花青苷,凤丹,生物合成途径

图 1-2 花青苷的生物合成途径（郭凤丹等，2011）Figure 1-2 Pathway of anthocyanin biosyntheticPAL: 苯丙氨酸解氨酶；C4H: 肉桂酸- 4-羟化酶；CHI: 查尔酮异构酶；CHS:查尔酮合酶；4CL: 4-羟基酶 A 连接酶；DFR: 二氢黄酮醇-4-还原酶；F3H: 黄烷酮 3-羟化酶；F3'H: 类黄酮 3'-羟化酶；GST: 甘肽 S-转移酶；UFGT: 尿苷二磷酸葡萄糖-类黄酮葡萄糖基转移酶；RT: 鼠李糖基转移酶查尔酮合成酶 CHS 作为花青苷生物合成途径中的一个重要的酶，，它可以催化酰辅酶 A 和 4-香豆酰辅酶 A 合成查尔酮。有研究指出在月季中，由于遮光而抑S 的表达从而导致了花冠不着色（骆菁菁等，2013）。将 CHS 基因导入矮牵牛源 CHS 基因表达紊乱，实现了内源基因与转基因共抑制现象，使矮牵牛花色呈样性（Jorgensen.，1995；化占勇等，2010）。以上可以表明 CHS 的活性与植物苷合成相关。查尔酮异构酶（CHI）在类黄酮生物合成中有不可代替的作用，黄色查尔酮由化变为无色的三羟基黄烷酮。黄烷酮可以合成植物中大部分类黄酮类物质。在花过抑制 CHI 的活性从而使花青苷合成途径受到抑制，花青苷合成能力下降（Nishal., 2005）。在园艺植物中，沙梨和苹果的果皮中 CHI 的活性和花青苷合成与代
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S668.4

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