转Bt基因水稻的配合力测定及时空表达分析

发布时间：2020-05-23 19:17

【摘要】：近年来水稻生产中一直面临着病虫害的危害,其中二化螟、三化螟的危害最为严重,主要原因在于目前在水稻中还没有发现抗螟虫的品种,抗螟虫基因的挖掘和定位一直进展缓慢。通过转基因技术将Bt基因导入水稻中获得具有抗虫性的转基因株系是当前解决问题的主要途径。通过分子生物学方法进一步了解转基因株系中Bt基因的表达规律,有利于全面地了解品种的抗虫特性,对指导水稻生产应用提供了参考依据。然而对于转基因技术,学界和社会一直存在着许多担忧,其中基因的插入在获得目标性状的同时,是否会引起其他非预期效应,从而造成安全性问题,是目前面临的主要问题之一。1、采用NCII不完全双列杂交配制35个组合,通过配合力分析得到配合力强的亲本和优良杂交组合。亲本的一般配合力(GCA)效应分析表明洪A、荃9311A、昌恢121T、昌恢T025T的GCA效应值高;杂交组合的特殊配合力(SCA)效应分析表明,荃9311A/昌恢T025T的9个农艺性状综合SCA效应值最好;67A/R205T的单株产量SCA效应值最高;荃9311A/昌恢606T具有最小的株高SCA效应值;穗长SCA效应值最大的是843A/昌恢891T;843A/昌恢121T的空批粒数SCA效应值最低,结实率SCA最高。荃9311A/昌恢T025T、67A/R205T、洪A/昌恢121T、843A/昌恢121T为优良杂交组合;2、利用实时荧光定量PCR研究cry1C、cry2A在新抗虫恢复系及其F_1内的时空表达规律,新抗虫恢复系及其F_1中cry1C、cry2A的基因表达情况如下:在叶片和茎秆中cry1C和cry2A表达量在分蘖期、幼穗分化期逐渐增加,直到抽穗期达到最高峰,灌浆期一直维持着较高的表达量,进入成熟期后迅速降低;在穗中cry1C和cry2A表达量从幼穗分化期开始逐渐增加,直到抽穗期达到最高峰,进入灌浆期后迅速下降,说明cry1C和cry2A在整个生长周期内的表达呈现前高后低的趋势,而且表达过程持续性强;从分蘖期至成熟期cry1C和cry2A表达量在叶片组织茎秆组织穗组织胚乳组织,说明cry1C和cry2A基因主要在稻纵卷叶螟和二化螟的主要危害部位表达;在亲代恢复系中cry1C和cry2A表达量要远远高于杂交组合F1,说明cry1C和cry2A可能存在某种形式的剂量效应;双价抗虫水稻cry1C、cry2A表达量低于单价抗虫水稻,并且表达规律复杂,说明cry1C、cry2A可能存在形式复杂多样的互作效应;在不同品种间cry1C、cry2A表达量存在一定差异,说明抗虫基因表达可能与水稻遗传背景紧密相关;3、Elisa检测Bt蛋白在新抗虫恢复系及其F_1内的时空表达规律,并对新抗虫恢复系及其F_1进行室内喂虫实验计算螟虫致死率,新抗虫恢复系及其F_1中Bt蛋白的表达情况和螟虫致死率如下:Bt蛋白的表达量均为抽穗期叶片分蘖期叶片,cry1C蛋白表达量的变化范围1.82ug/g~4.95ug/g,cry2A蛋白表达量的变化范围6.52ug/g~7.39ug/g,在接虫48h后二龄二化螟的螟虫致死率均为抽穗期叶片分蘖期叶片,螟虫致死率变化范围75%~85%;Bt蛋白的表达量均为抽穗期叶片抽穗期茎秆,cry1C蛋白表达量的变化范围0.16ug/g~4.95ug/g,cry2A蛋白表达量的变化范围0.31ug/g~7.39ug/g,而在接虫48h后二龄二化螟的螟虫致死率均为抽穗期茎秆抽穗期叶片,螟虫致死率变化范围75%~95%,研究发现在叶片中cry1C蛋白含量的最低致死阈值≤2.2ug/g,cry2A蛋白含量的最低致死阈值≤6.52ug/g;在茎秆中cry1C蛋白含量的最低致死阈值≤0.16ug/g,cry2A蛋白含量的最低致死阈值≤0.31ug/g;4、通过反向PCR扩增侧翼序列,再用巢式PCR对扩增产物进行富集,将产物进行测序,序列比对日本晴全基因组,结果发现cry1C侧翼序列片段大小为1276bp,定位在水稻11号染色体上,cry2A侧翼序列片段大小为948bp,定位在水稻12号染色体上;5、用216对SSR引物对实验组和对照组进行全基因组背景分析,昌恢121T、昌恢891T、昌恢T025T、R205选T的遗传背景回复率分别为95.60%、88.43%、93.52%、94.44%,4个恢复系已经基本恢复轮回亲本的主要特性;6、根据cry1C、cry2A的插入位点设计侧翼基因的跨内含子引物,real-time PCR检测外源基因插入位点上下游100Kb内9个基因的表达差异,结果表明实验组和对照组在cry1C、cry2A插入位置上下游100kb内9个侧翼基因的表达水平没有显著性差异;考察相关农艺性状发现实验组和对照组在光合特性与产量表型上没有显著性差异,研究进一步表明,cry1C和cry2A的插入不会引起侧翼基因表达水平的改变,转基因水稻在相关农艺性状上并未产生非预期效应。
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转基因农作物,和分布,全球,转基因水稻

图 1 2017 年全球商业化种植转基因农作物的种类和分布Fig1 Type and location of commercially grown genetically engineered crops in 20172 转基因水稻的研究进展2.1 转基因水稻的发展现状转基因水稻的发展要晚于其他转基因作物，主要原因在于水稻转基因技术的建立较为困难，日本科学家 Fujimoto 等将 cry1Ab 导入粳稻中和 Wunn 等将 cry1Ab 导入籼稻品种中，标志着转基因技术在水稻作物改良中的日趋成熟[12-13]。在中国，，主要害虫包括稻飞虱、螟虫、稻瘿蚊和稻蓟马等，转基因水稻的培育是当前抵御虫害的主要措施之一[14-15]，1994 年浙江大学首次在利用农杆菌转化法将 cry1Ab 基因导入秀水 11中[16]；2006 年华中农业大学将改良后的 cry1C 和 cry2A 基因与 rbcS 基因融合后导入水稻植株中，让 Bt 蛋白仅在绿色组织中表达，大大提高了转 Bt 基因水稻的食用安全性[17]。然而，在转基因水稻的应用推广上，我国还需进一步完善技术体系、人才体系和市场体系，尤其在基因的功能验证与价值评价等中间环节和转化事件上的技术完善是当前我国转基因产业化迫切需要解决的核心问题；在品种特性上，转基因水稻的目标性状较单一；在品种研发上，转基因水稻的研发与推广分离导致品种的选育与市场

示意图,原理,示意图,克螟稻

ELISA 即酶联免疫吸附法是目前应用最广泛的免疫检测方法，它的基本原理原抗体的特异性结合和酶对底物的高效催化，由瑞典 Egnvan 和 Perlmann 与荷兰Vanweeman 和 SehuurS 在 1971 年分别创立。近十年来，科学界们利用 ELISA 法Bt 蛋白在转基因作物中的表达含量。Voller 等最早将 ELISA 技术应用于苹果花叶毒（Apple Mosaic Virus，ApMV）的检测[80]；Clark 等将 ELISA 技术应用于南芥叶病毒（Arabis Mosaic Virus，ArMV）和李痘病毒（Plum Pox Virus，PPV）的检标志着 ELISA 技术正式应用到植物蛋白检测上[81]；Shah 等最早建立了双抗体夹ELISA 法用于检测转基因棉花中 Cryl Ac 蛋白[82]；我国 ELISA 检测法的研究开始陈松、王保民、沈法富等对于转基因抗虫棉中 ICPs 表达量的检测[83-85]；王硕等开出了 Bt 棉花中 CrylAc 蛋白的双抗夹心 ELISA 检测方法，该 ELISA 检测体系中抗体为多抗[86]；转基因水稻中外源蛋白的检测体系研究稍晚，2001 年谢小波等用剂盒检测了转 Cry1Ab 基因的克螟稻 1 号和克螟稻 2 号及未转化的秀水 11 米粒中Bt 蛋白含量，结果的相关性非常理想[87]。之后有关 ELISA 检测 Bt 毒蛋白含量的陆续开始。5 侧翼序列的分离方法
【学位授予单位】：江西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S511

【参考文献】