RNA干扰介导的AQP5基因沉默对非小细胞肺癌的作用及其相关通路研究

发布时间：2020-05-23 22:44

【摘要】：背景:肺癌是世界范围内发病率和死亡率均较高的恶性疾病之一,而非小细胞肺癌(Non-small-cell lung cancer,NSCLC)是其最常见的类型,约占所有肺癌病例的80%。肺癌常规的治疗方法包括外科治疗、放射治疗、化学治疗,随着分子生物学的迅猛发展,靶向治疗正在逐步成为肺癌的主要治疗手段之一。因此,寻找NSCLC发病过程中的关键基因和相关信号通路,并揭示其中的分子机制,对于NSCLC靶向治疗至关重要。研究者们先已发现了许多在NSCLC发生、发展过程中起决定作用的癌基因和癌相关蛋白,为治疗提供了新的研究和治疗思路。水通道蛋白5(Aquaporin 5,AQP5)一种跨细胞膜的水通道蛋白,具有调节细胞内水平衡的作用。近期有研究表明,AQP5在多种肿瘤细胞中表达上调,可促进恶性肿瘤细胞的增殖,对其进行基因沉默可抑制肿瘤生长。但AQP5与NSCLC之间的相关性仍有待探索。目的:在国内外研究的基础上,通过基因工程重组技术沉默AQP5基因在NSCLC细胞中的表达,系统评价AQP5对NSCLC细胞增殖凋亡、迁徙侵袭等生物学功能的影响,并进一步探讨AQP5基因沉默后对相关功能蛋白的及信号转导通路的影响,阐述AQP5与NSCLC发生发展的密切关系及相关的信号转导通路及分子机制,为NSCLC的治疗提供新靶点。方法:1.Western Blot方法检测正常人肺细胞MRC-5和人肺癌细胞系HCC827、A549、H1299、H358中AQP5的表达水平,筛选出AQP5高表达细胞系A549。设计并构建特异性真核表达质粒AQP5-p GCH1/Neo和阴性质粒NC-p GCH1/Neo,利用脂质体转染入A549细胞,构建AQP5基因沉默细胞及阴性对照组细胞。Real-time PCR和Western Blot方法检测并比较未处理细胞组、阴性对照组及基因沉默组细胞的AQP5基因和蛋白表达水平。2.利用细胞集落形成实验,MTT法检测各组细胞增殖活力,采用流式细胞术考察细胞周期分布及细胞凋亡差异;Western Blot法检测细胞凋亡通路相关蛋白Bcl-2、Cleaved caspased-3和Bax的表达情况。3.划痕实验观察三组细胞的迁移能力,Transwell侵袭实验观察侵袭能力,Western Blot法检测肿瘤转移相关蛋白MMP-2,MMP-9和Vimentin表达水平。4.利用Western Blot对ERK1/2信号通路相关蛋白p-ERK、p-CREB和c-fos表达量进行检测,探讨AQP5对ERK1/2信号通路的影响。5.在上述体外实验的基础上,将未处理细胞组、阴性对照组及基因沉默组三组细胞接种于裸鼠皮下,建立体内异种移植瘤模型,观察体内情况下AQP5表达下调对肿瘤细胞的增殖和凋亡影响。结果:1.成功构建含有AQP5 sh RNA的AQP5-p GCH1/Neo质粒和阴性对照质粒NC-p GCH1/Neo,并转染至A549细胞;转染AQP5-p GCH1/Neo质粒的A549细胞中AQP5基因和蛋白表达水平均显著降低。2.细胞集落实验表明,AQP5 sh RNA组形成细胞集落能力显著下降;MTT实验表明AQP5 sh RNA细胞组各时间点吸光度均降低,时间越长,差异越显著。流式细胞仪结果表明AQP5 sh RNA组细胞阻滞在G0/G1期,而在S期、G2/M期细胞数量显著减低,并且凋亡显著。凋亡相关蛋白检测结果显示AQP5 sh RNA组Bcl-2表达下调,Cleaved caspased-3和Bax表达上调,Bcl-2/Bax比值降低,说明AQP5基因沉默抑制肿瘤细胞增殖,阻滞细胞周期,抑制肿瘤细胞分裂,并可通过调控Bcl-2家族凋亡相关蛋白促进A549细胞凋亡。3.细胞迁移实验结果显示AQP5 sh RNA组细胞迁移能力下降。Transwell细胞侵袭实验表明AQP5 sh RNA组进入下层小室细胞减少,侵袭能力下降。Western Blot结果显示肿瘤转移关键因子MMP-2和MMP-9和间质细胞转化标志蛋白Vimentin表达降低,说明AQP5表达下调降低肿瘤细胞侵袭能力,抑制肿瘤细转移。4.AQP5 sh RNA组细胞p-ERK、p-CREB和c-fos表达量均显著降低。说明AQP5表达下调可降低ERK1/2信号通路蛋白磷酸化,抑制ERK1/2信号通路。5.AQP5 sh RNA组小鼠的肿瘤体积、重量显著小于对照组,肿瘤生长速度明显下降;Tunel法检测肿瘤凋亡结果显示AQP5 sh RNA组小鼠肿瘤组织中凋亡细胞更多。说明在体内环境下,AQP5基因沉默可抑制肿瘤增殖,促进肿瘤凋亡。结论:1.使用RNAi技术建立了非小细胞肺癌A549细胞的AQP5基因沉默细胞系。2.证实AQP5与非小细胞肺癌A549生物学功能关系密切,表达下调抑制肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭,促进肿瘤细胞凋亡,并能调控相关功能蛋白的表达水平,对ERK1/2信号通路有抑制作用。3.为非小细胞肺癌的诊断和治疗提供新的潜在标志物及靶点。4.为RNA干扰技术治疗肿瘤疾病提供实验研究数据。
【图文】：

结构示意图,调控机制,分子机制,蛋白表达

图 1 AQP5 结构示意图[94]显示 AQP5 的基本单体Fig1 structure diagram display the basic monomer of AQP52.2 AQP5 的调控机制尚未完全了解 AQP5 蛋白表达调控的分子机制。然而，已知 AQP5 基因的启

质粒图谱,插入序列,序列

图 1.1 pGCsi-H1/Neo/GFP 质粒图谱ure 1.1 Plasmid Profile of pGCsi-H1/Neo析比对，表明插入序列与设计序列完全粒。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R734.2

【参考文献】