基于三代测序技术的高产糖化酶黑曲霉工业菌株基因组组装与注释及功能基因比较研究

发布时间：2020-05-23 23:27

【摘要】：黑曲霉是工业生产中常用的丝状真菌。本研究的研究对象黑曲霉SH2、HL_1具有不产孢子、蛋白分泌能力强等特点,并且可以进行高密度发酵在大规模发酵中应用广泛。第三代基因组测序技术即单分子测序技术,没有PCR扩增,杜绝了扩增引入碱基的错误,同时以其独特的读长特点,显著减少后续的基因拼接以及提高功能注释的质量,在基因组测序中具有显著的优势。本研究应用第三代单分子测序技术,对黑曲霉SH2和黑曲霉HL_1进行测序,通过组装、功能基因注释,分别将这两菌株和黑曲霉CBS513.88进行比较基因组学研究,从基因和功能蛋白表达等方面阐述两株菌的遗传学特性。本研究的主要内容和结果如下。1.黑曲霉SH2、HL_1基因组组装及功能基因注释基于Pac Bio平台,应用第三代单分子技术对黑曲霉SH2和黑曲霉HL_1进行全基因组测序,获得原始reads,用Celera、Falcon软件分别进行组装,获得最优结果,其中黑曲霉SH2获得11个Scaffold,基因组大小为34.4Mb,基因11348个,外显子35883个,蛋白质编码区11348个,t RNA 317个,r RNA 57个,s RNA 62个,sn RNA 28个,mi RNA170个,GC含量49.74%。黑曲霉HL_1获得28个contigs,基因组大小为34.6 Mb,基因10821个,外显子35582个,蛋白质编码区10821个,t RNA300个,s RNA4个,sn RNA18个,GC含量49.49%。2.黑曲霉菌株SH2、HL_1与模式菌株CBS513.88的比较基因组分析将黑曲霉SH2、HL_1的基因组序列与黑曲霉模式菌株CBS513.88进行核苷酸层次以及蛋白质层次的同源性分析,通过比对得出三菌株的基因组成差异以及两菌株所缺失的基因,并通过PCR验证生物信息学的分析结果,完善黑曲霉SH2和HL_1的基因组信息。其中,与黑曲霉菌株孢子发育相关的核心基因是An18g01170(Prp A),模式菌株CBS513.88存在该基因,将黑曲霉SH2和黑曲霉HL_1与模式菌株进行全基因组比对,比对结果显示黑曲霉SH2缺少该基因,而黑曲霉HL_1存在该基因,并且与CBS513.88是100%匹配,这与SH2菌株无孢子的表型以及HL_1产少量孢子的表型吻合。同时,两菌株在蛋白质翻译表达方面的基因富集较多,从理论上论证SH2和HL_1能够成为工业生产中异源蛋白表达宿主的原因。系统进化分析结果显示,SH2与ATCC-1015亲缘关系较近,HL_1与CBS513.88亲缘关系较近,该结果为明确工业黑曲霉菌株之间的亲缘关系以及进化演变地位提供理论支持。3.对黑曲霉SH2、HL_1关键代谢基因的注释与分析黑曲霉SH2和黑曲霉HL_1是工业生产细菌,用于糖化酶生产以及异源表达宿主,对与蛋白翻译转录以及分泌相关的基因簇聚类有重要工业价值,本研究主要对蛋白水解酶基因簇、多糖降解酶基因簇、转录因子基因簇、次级代谢基因簇以及与细胞壁相关基因簇进行聚类,并且构建了两株黑曲霉的中心代谢网络,这些信息对于利用基因修饰工术对菌株进行改造,从而进一步提高其蛋白分泌量有一定的参考价值。通过对两株黑曲霉的密码子使用频率进行分析,获得了两株菌蛋白基因高表达高使用频率密码子ATG(甲硫氨酸,Met)、TGG(色氨酸,Trp),为工业菌株密码子优化及其改造提供参考。本论文旨在利用第三代单分子技术对两株黑曲霉SH2和HL_1进行全基因组测序,并进行功能预测以及注释,分析所有基因功能,充分了解两株黑曲霉的遗传特性、转录、以及表达等特点和机理,通过比较基因组学的研究,完善两菌株的基因层面的信息,为现代化的工业生产提供遗传信息支持,同时也为微生物基因组学的研究提供技术以及数据分析参考。构建了这两株高产糖化酶黑曲霉的中心代谢途径,并对其蛋白水解酶基因簇、多糖降解酶、次级代谢基因簇、与细胞壁相关基因簇聚类,这些基因簇与蛋白的表达或者分泌有一定的联系,同时也对两株菌的密码子偏好性进行分析,这对于菌株改造、基因修饰或者密码子优化有一定的指导作用,对于进一步提高蛋白的产量有重要意义。
【图文】：

黑曲霉,分生孢子梗,扫描电镜图

图 1-1 黑曲霉分生孢子梗的扫描电镜图[1]Fig. 1-1 Scanning electron microscope photo of Aspergillus niger conidial head[1]黑曲霉工业应用霉是重要的工业菌株，由于其独特的生理特性以及强大且丰富的降解酶系适应多种培养环境，并且能快速生长发酵，及时在 pH 数值较低的环境中盛的代谢活性，同时不易受到杂菌污染，广泛用于有机酸和生物制剂生产上常见的淀粉酶、纤维素酶、葡萄糖酶、木聚糖酶[3]、单宁酶、植酸酶[4]等不同成分的培养基产生不同的酶制品组合。酶制品外，黑曲霉还应用于柠檬酸的生产中，而柠檬酸制药、饮品等领域原料，目前全世界生产的柠檬酸中，超过 90%是由黑曲霉发酵获得。另外食子等有机酸的生产菌株。霉在低 pH 中旺盛的代谢活性，可在废水处理中用来降解有机物质，其胞

技术路线图,生物信息学分析,技术路线

图 2-4 生物信息学分析技术路线Fig. 2-4 Bioinformatics analysis technology route2.2 实验方法2.2.1 黑曲霉 SH2 和 HL_1 的 DNA 提取及测序两菌株 SH2 和 HL_1 基因组的提取主要参考 Raeder[47]等发表的方法,测序是应用PacBio 平台，，主要的方法和步骤如下：1）首先收集 DPY 培养基中黑曲霉 SH2 和 HL_1 菌丝，去除培养基杂质2）分别转移 SH2 和 HL_1 菌丝体至研钵内，液氮下均匀研磨，接着加入适量溶菌缓冲液3）分别加入等体积氯仿：苯酚：异戊醇（24:25:1）混合液后分别抽提 DNA 两次4）分别吸取上清液（V:代表体积）加入到 2 倍体积无水乙醇（absolute ethyl alcohol）中，-20。C 沉淀 2 h
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q78

【参考文献】