桦褐孔菌三磷酸甘油醛脱氢酶基因及启动子的克隆与分析

发布时间：2020-05-24 19:26

【摘要】：桦褐孔菌Inonotus obliquus(Ach.ex Pers.)Pilat属锈革孔菌科,纤孔菌属,主要成分有多糖、桦褐孔菌醇、桦褐孔菌素、三萜类化合物等,具有抗癌、降血糖、降血脂、抗氧化等多种药用功能。三磷酸甘油醛脱氢酶(GPD)是维持生命活动最基本的酶之一,参与组织中的糖酵解过程,常用于真菌的逆境胁迫和菌种的分类鉴定。GPD启动子含有TATA box、CART box和一个多CT序列,具有很强的调控异源基因转录的功能,目前GPD启动子已经作为外源基因启动子用于转化香菇、平菇、草菇、双孢菇、灵芝等。本试验以桦褐孔菌为试验材料,克隆GPD基因及启动子序列,并对其进行分析,为桦褐孔菌菌株的分类鉴定、功能研究及高效表达载体的建立提供基因资源。1.使用简并引物PCR和RACE技术克隆了桦褐孔菌GPD基因(IoGPD)的全长序列,其长度为1223 bp,编码339个氨基酸。2.氨基酸序列分析表明,IoGPD没有信号肽序列,定位于细胞质,属于3-磷酸甘油醛脱氢酶家族中的I型。3.对IoGPD编码的氨基酸序列进行相似性搜索,结果显示IoGPD与真菌的GPD同源,与同属纤孔菌属的鲍姆桑黄和同为锈革孔菌科的地中海嗜蓝孢孔菌GPD蛋白相似性最高,达88%。4.利用染色体步移技术从桦褐孔菌JL01菌株中成功克隆获得了 IoGPD启动子序列446 bp。5.序列分析结果表明IoGPD启动子在152 bp和160 bp处有两个转录起始位点,含有TATA、CAAT、CCAATbox等启动子基本元件,而且还包括调控低温、光照、生理昼夜节律控制和参与蛋白代谢调节等重要顺式作用元件LTR、02-site、circadian、Sp1、TCCC-motif等。
【图文】：

三磷酸甘油醛,脱氢酶基因,基因,醛脱氢酶基因

２．１三磷酸甘油醛脱氢酶基因全长的克隆逡逑２．１．１桦褐孔菌总ＲＮＡ的提取逡逑使用Ｔｒｉｚｏｌ改良法提取桦褐孔菌总ＲＮＡ邋（如图１所示），图中２８Ｓ、１８Ｓ清逡逑晰可见，且２８Ｓ条带亮度是１８Ｓ条带亮度的两倍，说明ＲＮＡ完整降解少，效率逡逑高，可用于进行后续试验。逡逑：二逡逑ｙ：二：逡逑图１桦褐孔菌总ＲＮＡ电泳检测图逡逑Ｆｉｇ．ｌ邋Ｔｏｔａｌ邋ＲＮＡ邋ａｇａｒｏｓｅ邋ｇｅｌ邋ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｏｆ邋Ｉｎｏｎｏｔｕｓ邋ｏｂｌｉｑｕｕｓ逡逑２．１．２三磷酸甘油醛脱氢酶基因片段的克隆逡逑将提取的桦褐孔菌总ＲＮＡ进行反转录合成ｃＤＮＡ第一条链，以此为模板进逡逑行简并ＰＣＲ扩增，获得ＧＰＤ基因片段与预期大小相一致（如图２所示）。基因逡逑片段测序结果表明，ＧＰＤ基因片段长９４５邋ｂｐ，基因比对结果显示，三磷酸甘油逡逑醛脱氢酶基因片段与云芝（ＸＭ＿００８０４１８９７．１邋）基因相似性为９７％，因此，初步逡逑判定该基因片段为桦褐孔菌的ＧＰＤ基因片段。逡逑Ｍ１２３逦４５６７逡逑５００邋ｂｐ—？邋■逡逑图２桦褐孔菌ＧＰＤ基因片段的电泳检测图逡逑Ｆｉｇ．２邋Ａｇａｒｏｓｅ邋ｇｅｌ邋ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｏｆ邋ｆｒａｇｍｅｎｔｓ邋ｏｆ邋ＧＰＤ

电泳图,电泳图,三磷酸甘油醛,脱氢酶基因

根据获得的ＧＰＤ基因片段设计基因特异性引物，将提取的总ＲＮＡ按照逡逑ＲＡＣＥ试剂盒的要求进行ｃＤＮＡ第一条链的合成，然后进行ＰＣＲ扩增获得ＧＰＤ逡逑基因的５１端和端（如图３所示），将其进行回收、连接、转化等操作后送去测逡逑序。逡逑Ｍ邋１逦２逦Ｍ邋１逦２逡逑２000ｂＰ—？逦sE二逦焌灥奏看逡逑Ｂ１逦Ｂ２逡逑图３桦褐孔菌ＧＰＤ基因的５ＨＡＣＥ和ＴＲＡＣＥ电泳图逡逑Ｆｉｇ．３邋Ａｇａｒｏｓｅ邋ｇｅｌ邋ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｏｆ邋５邋＾ＲＡＣＥ邋ａｎｄ邋３邋＾ＡＣＥ邋ｏｆ邋ＧＰＤ邋ｇｅｎｅ逡逑Ｍ：邋ＤＬ２０００邋ｍａｒｋｅｒ；邋Ｂｌ：邋５，ＲＡＣＥ邋产物；Ｂ２：邋３，ＲＡＣＥ邋产物逡逑Ｍ：邋ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ；邋Ｂ１：邋Ｐｒｏｄｕｃｔｓ邋ｏｆ邋５＇ＲＡＣＥ；邋Ｂ２：邋Ｐｒｏｄｕｃｔｓ邋ｏｆ邋３ｆＲＡＣＥ逡逑２．１．４三磷酸甘油醛脱氢酶基因全长的克隆逡逑将扩增得到的保守区片段与ＲＡＣＥ克隆获得５＇端和３＇端序列进行拼接，并根逡逑据拼接结果设计用于克隆三磷酸甘油醛脱氢酶基因全长的特异性引物，以ｃＤＮＡ逡逑为模板，进行ＰＣＲ扩增（如图４所示），将ＰＣＲ产物进行切胶、回收、连接转逡逑化和菌液检测后送去测序。三磷酸甘油醛脱氢酶基因全长测序结果表明基因编码逡逑区序列与序列拼接结果一致。三磷酸甘油醛脱氢酶基因的全长序列为１２２３邋ｂｐ，逡逑ＧｅｎＢａｎｋ登录号为ＫＸ９８６８０１．］，因此可以确定克隆得到了三磷酸甘油醛脱氢酶逡逑基因的全长序列，，将其命名为／0Ｇ／＞￡＞?
【学位授予单位】：延边大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S567.3

【参考文献】