神农香菊单萜合酶基因的克隆及对野菊的遗传转化

发布时间：2020-05-24 23:03

【摘要】：神农香菊(Chrysanthemum indicum var.aromaticum)是野菊(Chrysanthemum indicum)的一个新变种,全株主要化学成分为a-侧柏酮、β-侧柏酮、龙脑等萜类化合物,其花、叶、根均具有浓郁的香气,是菊属中罕见的芳香型观赏花卉。萜类合酶(terpene synthase,TPS)是植物萜类代谢途径中的一类关键酶,对植物体内的芳香物质起到重要的调控作用。本研究欲探究神农香菊单萜合酶基因(CiTPS)对植物中单萜物质的调控的作用,通过将CiTPS基因在烟草中过表达,初步探究CiTPS基因的调控功能,再对野菊进行遗传转化,以期更好挖掘神农香菊的芳香价值及改善野菊的芳香品质,同时也为今后培育色香型俱佳的菊花品种奠定理论基础。本研究以神农香菊为实验材料,在本实验室前期神农香菊转录组数据的基础上,克隆获得CiTPS基因,对其进行生物信息学分析;构建过表达植物载体,转化烟草,初步探究了 CiTPS基因的功能;优化野菊的遗传转化体系,最终将CiTPS基因转入野菊中。研究结果如下:1.克隆获得的CiTPS基因开放阅读框(OOF)长度为1818bp,编码6005氨基酸;该基因具有单萜合酶的典型保守域和功能高度保守序列,即DDXXD、(N,D)D(L,I,V)X(S,T)XXXE和RRX8W,属于单萜类合酶家族,具有合成单萜物质的功能;该基因所编码的蛋白质相对分子量为70.1 1kDa,理论等电点(pI)为5.80,为不稳定蛋白,亲水性较强;多序列比对和系统进化树分析显示,CiTPS基因序列与黄花蒿的反式芳樟醇OH1基因序列相似度可以达到91%,TPS基因属于TSPb家族,其编码的蛋白与黄花蒿和蓟中TPS编码的蛋白同源关系较近,。2.在已获得神农香菊CiTPS基因的基础上,双酶切构建了pBI121-TPS-GFP植物过表达载体,通过电转化法将pBI121-TPS-GFP重组质粒和pBI121-GFP空载体质粒导入农杆菌中,并利用农杆菌介导法成功转入烟草植株体内。通过抗性生根筛选、抗性植株DNA和RNA的PCR检测以及不同烟草株系的qRT-PCR检测,证明成功获得6株转CiTPS基因和1株转pBl1 21-GFP空载体的阳性烟草株系,并筛选出3株转CiTPS基因烟草株系,分析其和野生型烟草、转空载烟草T1代叶片在旺盛生长期的分泌物,初步探究出CiTPS基因具有提高植物体内单萜物质的功能。3.野菊叶盘在含1.0 mg/L 6-BA和0.8 mg/L NAA的MS培养基上诱导效果最佳,其遗传转化的卡那霉素最适分化临界耐受浓度为8 mg/L,最适生根临界耐受浓度为10 mg/L,头孢霉素抑菌浓度在筛选培养阶段选用200 mg/L最佳。叶盘在经过预培养2 d,侵染10 min,共培养3 d后,遗传转化效率最高。利用农杆菌介导法将CiTPS基因和pBI121-GFP空载体转入野菊,通过生根筛选、抗性植株DNA和RNA的PCR检测,证明已成功过获得3株转CiTPS基因和2株转pBI121-GFP空载体的阳性转野菊株系。
【图文】：

２．３结果与分析逡逑２．３．１总ＲＮＡ电泳及浓度检测逡逑神农香菊叶片总ＲＮＡ邋（图２－１）的５邋ｓ、１８邋ｓ和２８邋ｓ三条核糖体带都清晰可见，说明逡逑所提神农香菊叶片ＲＮＡ的完整性好，质量较高并且无降解，可以进行下一步的实验。逡逑瓜—■逡逑图２－１神农香菊ＲＮＡ电泳图逡逑Ｆｉｇ．２－１邋Ｑｕａｎｔｉｔｙ邋ｏｆ邋ｅｘｔｒａｃｔｅｄ邋ｔｏｔｏｌ邋ＲＮＡ邋ｏｆ邋Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ邋ｉｎｄｉｃｕｍ邋ｖａｒ．邋ａｒｏｍａｔｉｃｕｍ逡逑－１２－逡逑

逦２神农香菊７ＰＳ基因克隆及生物信息学分析逦逡逑２．３．２邋７７Ｗ基因克隆与序列分析逡逑以神农香菊幼苗叶片总ＲＮＡ经反转录获得的ｃＤＮＡ为模板，利用ＰＣＲ扩增获得目逡逑的片段（图２－２）。用胶回收试剂盒回收ＰＣＲ产物，将其与ｐＵＣ－Ｔ载体连接后转化大肠逡逑杆菌ＤＨ５ｏｔ菌株感受态，利用ＰＣＲ扩增的方法筛选出１０个阳性克隆（图２－３），选取３逡逑个条带亮度好的克隆进行测序。结果显示，基因序列具有完整的ＯＲＦ，其序列长度为逡逑１８１８ｂｐ，可以编码６０５个氨基酸的多肽链（图２－４），该序列具有单萜类合酶的典型保守逡逑域和功能高度保守序列，即ＤＤＸＸＤ、（Ｎ，Ｄ）邋Ｄ邋（Ｌ，Ｉ，，Ｖ）邋Ｘ邋（Ｓ，Ｔ）邋ＸＸＸＥ和逡逑ＲＲＸ８Ｗ，这表明所克隆的基因属于单萜类合酶家族，将该基因序列命名为Ｃ／７７＾，并将逡逑序列在ＮＣＢＩ上进行登录，登录号为ＭＨ１２４７３７。逡逑．．—．逡逑
【学位授予单位】：东北林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S682.11

【参考文献】

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本文编号：2679135