水稻黄绿叶突变体ygl15的鉴定和候选基因分析

发布时间：2020-05-25 10:22

【摘要】：水稻叶色突变是一类常见、易识别且表型出现较早的突变。近年来,针对水稻叶色突变已广泛开展研究,尤其在植物光合作用机制、叶绿素生物合成途径、叶绿体的发育和遗传控制机理等方面。水稻黄绿叶突变体ygl15(yellow green leaf 15)是利用化学诱变剂EMS(Ethyl methane sulfonate)诱变籼稻保持系西农1B种子而获得。本研究以野生型西农1B为对照,探究了突变体ygl15的表型特征、主要农艺性状、光合特征参数、光合色素含量及其他生理生化指标、叶绿体的荧光显微镜观察、相关叶色基因的定量表达;利用突变体ygl15和中花11杂交后代中F_2群体进行遗传分析和分子定位,并对区间内的候选基因进行分析和测序。主要结果如下:1.表型鉴定和农艺性状考察突变体ygl15在两叶期开始出现黄绿色表型,且该表型一直持续到成熟期。主要农艺性状方面,与野生型相比,突变体的株高、每穗总粒数、每穗实粒数和千粒重极显著降低,穗长显著降低,但有效穗数与野生型相比相差不大,未达到显著差异水平。2.光合色素含量测定分别测定了苗期和抽穗期野生型及突变体ygl15叶片中光合色素含量。与野生型相比,突变体ygl15苗期的叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素以及总叶绿素的含量极显著降低;抽穗期倒一叶的叶绿素a、类胡萝卜素及总叶绿素含量极显著降低,但叶绿素b含量差异不显著;倒二叶的各项光合色素含量均极显著降低;倒三叶除叶绿素b含量显著降低外,其它光合色素含量也极显著降低。3.光合参数分析抽穗期对野生型和突变体ygl15的净光合速率、气孔导度、胞间CO_2浓度、蒸腾速率4个光合特性指数进行测定。结果显示,与野生型相比,ygl15的气孔导度、胞间CO_2浓度和和蒸腾速率均有所增加,但只有蒸腾速率达到显著差异水平。而净光合速率则较野生型降低,但未达到显著差异水平。可能因为气孔导度增加,蒸腾速率加快,更容易摄入空气中的CO_2,从而增加了胞间CO_2浓度。4.冷冻切片观察分蘖期选取长势相近的野生型和突变体ygl15叶片为材料制作冷冻切片,于荧光显微镜下观察,结果显示,突变体ygl15的叶绿体在紫外光下产生的红色荧光弱于野生型,说明突变体发生了叶绿素降解。5.遗传分析中花11与突变体ygl15杂交得到的F_1表型与野生型相同,F_1自交得到的F_2代群体中出现了性状分离,其中总单株数为2202,出现黄绿叶表型的单株数为518,经过卡方检验符合孟德尔分离比3:1(c~2=1.20c~2_((0.05,1))=3.84),说明该突变体ygl15表型受1对隐性核基因控制。6.生理及生化指标含量的测定抽穗期分别测定了野生型和突变体的各项生理及生化指标。结果表明,突变体ygl15的·OH含量倒一、倒二叶比野生型极显著降低,而倒三叶的差异不显著;O_2~-的含量倒一、倒二和倒三叶均极显著高于野生型;H_2O_2的含量较野生型倒一、倒二和倒三叶高,且倒二叶达到了显著差异水平,而倒一、倒三叶差异不显著;突变体ygl15的倒一、倒二和倒三叶T-SOD酶活性均极显著低于野生型;POD酶活性均低于野生型,且倒一、倒三叶差异极显著,而倒二叶差异不显著;CAT酶活性也均低于野生型,且倒三叶差异显著,而倒一、倒二叶差异不显著。7.分子定位及候选基因分析通过分子定位,将突变基因YGL15初步定位于水稻第10染色体长臂端RM25654与r3两分子标记之间,其遗传距离分别为0.38cM和0.57cM,物理距离约为56Kb,区间内有10个注释基因,测序分析发现,候选基因:LOC_Os10g35370的编码区第一个内含子(总长138bp)的第121个碱基由A突变为T,由于该位点的突变,可能会使该基因转录后mRNA的剪接过程受到影响,从而使其编码的原叶绿素酸酯氧化还原酶B蛋白序列发生改变,叶绿素合成中的原叶绿素酸酯光还原成叶绿素酸酯反应步骤受阻,最终导致突变体中叶绿素含量下降,出现黄绿叶表型。因此我们初步推测ygl15可能为候选目的基因。8.基因的表达分析分蘖期利用实时荧光定量PCR(quantitative Real-time PCR)分析了野生型西农1B和突变体ygl15光合作用通路中的光系统相关基因(petA、petB、petD、psaA、psbA、Cab1R)、叶绿素代谢途径相关基因(HEMD、HEMA1、CHLD、HEME、CAO1)以及调控类胡萝卜素代谢途径相关基因(PSY1和PSY3)的表达情况。结果表明,这些基因在突变体ygl15中的表达量均极显著低于野生型。
【图文】：

降解途径,植物,血红素

第 1 章文献综述途径的中间产物，能直接与谷氨酞 tRNA 还原酶结合，主要能反馈抑制植物体内叶绿素合成[56]。这个反馈抑制机制最直接的证据是，Terry 等[57]在研究番茄突变体aurea 和 yellow-green-2 中得到了证明，由于光敏色素和血红素氧化酶(hemeoxygenase)生成的团合酶（PFB synthase）基因发生了变异，致使血红素不能正常的降解，植物体内的血红素含量产生积累，反馈抑制叶绿素生物合成，使叶绿素含量降低，引起植株突变体叶色黄化。ALA 是血红素和叶绿素合成途径的前体物质，Lascelles 等[58]通过研究光合细菌不同的 ALA 合成途径发现，植物体内血红素含量可以影响血红素自身的生理浓度，且能够作为一种信号物质进行反馈调节，有效降低了光氧化性质对植物的损害。Li 等[59]利用插入 T-DNA 突变得到了幼叶萎黄转黄化叶突变体 ylc2，是编码血红素加氧酶（OsHOS）亚家族 OsHO2 的突变体，在该突变植株中发现色素在老叶中积累但新叶仍表现黄化，代谢产物测定发现该突变体的叶绿素和光敏色素前体的比正常水平低，而 Mg 原卟啉 IX 和 5-氨基乙酰丙酸含量发生积累，说明在血红素合成途径中 OsHO2 能有效的调节四吡咯生物合成。Chl a酸性 pH

生物合成,类胡萝卜素

西南大学硕士学位论文主要是β-胡萝卜素和γ-胡萝卜素。类胡萝卜素在植物的光保护途径中起着至关重要的作用，在光合作用过程中，可以通过热耗散消除过剩能量，减少有害活性氧的生成[60,61]。此外，作为光合作用的辅助色素防止光氧化损伤的光保护器，类胡萝卜素也可以是 ABA 激素的前体，Bewley[62]通过对种子萌发与休眠的分析，提供了强有力的证据表明 ABA 生物合成能抑制 PHS 的基因表达。Fang 等[63]在水稻中筛选、并鉴定了 12 个 PHS 突变体(PHS)，发现编码类胡萝卜素生物合成途径的主要酶，包括八八氢番茄红素脱氢酶（OsPDS）、ζ-胡萝卜素去饱和酶（OsZDS）、类胡萝卜素异构酶（OsCRTISO）和番茄红素β-羟化酶（β-OsLCY），，这些酶在ABA 类胡萝卜素前体生物合成中扮演着重要作用，缺一不可；而突变体 phs 中，ABA 的数量减少，在光系统中发生光抑制，大大增加活动的活性氧（ROS）清除酶，并减少光系统 II（PS）核心蛋白质 CP43、CP47 和 D1 的含量，这些结果表明，光氧化性质和脱落酸 ABA 合成受类胡萝卜素调控，若在类胡萝卜素合成过程中发生缺陷，会打破成熟穗的籽粒休眠开始发芽，叶片表型也出现白化。Fe2+Fe 原卟啉 IX血红素光敏色素生色团
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S511

【参考文献】