敲低NUPR1基因对多发性骨髓瘤细胞增殖和凋亡的影响及其机制研究

发布时间：2020-05-26 15:26

【摘要】：目的:构建核蛋白1-短发夹RNA(NUPR1-shRNA)慢病毒载体定向敲低NUPR1基因,研究NUPR1基因下调对人多发性骨髓瘤U266和RPMI8226细胞增殖和凋亡的影响及其可能机制。方法:以健康人骨髓单个核细胞为对照,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测骨髓瘤U266和RPMI8226细胞及MM患者骨髓细胞NUPR1 mRNA水平。设计针对NUPR1基因的shRNA序列并包装慢病毒载体;筛选最佳靶点,分别感染U266和RPMI8226细胞,流式细胞术观察转染效率;qRT-PCR、Western blot法验证NUPR1基因干扰效果。CCK-8法检测细胞增殖活力,流式细胞术检测细胞凋亡和周期,qRT-PCR、Western blot检测增殖和凋亡相关基因、蛋白的表达。结果:与健康人骨髓单个核细胞相比,MM细胞系(U266和RPMI8226)和MM病人骨髓细胞NUPRImRNA水平增高。慢病毒载体构建成功,两细胞系慢病毒感染效率均达80%以上;qRT-PCR和Western blot显示NUPR1-shRNA2慢病毒敲低效果最好,为最佳靶点。与对照组相比,敲低NUPR1表达后,U266和RPMI8226细胞增殖活力明显减弱;下调NUPR1表达后,U266和RPMI8226细胞凋亡率明显增加(P0.05);NUPR1下调组细胞较对照组细胞发生G0/G1期阻滞(P0.01)。与阴性对照组相比,qRT-PCR和Western blot显示Bcl-2、PCNA水平明显下调,PTEN水平显著升高;同时cleaved caspase-3、cleaved caspase-8 和 cleaved caspase-9 蛋白表达明显上调。结论:与健康人骨髓单个核细胞相比,U266、RPMI8226细胞和MM病人骨髓细胞NUPR1表达水平较高。敲低U266和RPMI8226细胞NUPR1,可明显抑制细胞增殖并促进其凋亡。其机制可能是敲低NUPR1后可激活线粒体凋亡通路和调控PCNA及PTEN的表达。提示NUPR1在MM中是一个促癌基因,其有可能成为MM治疗的潜在靶点。
【图文】：

骨髓标本（１２例）及正常人（４例）骨髓单个核细胞中表达水平。结果表明，ＮＵＰＲ１逡逑ｍＲＮＡ在ＭＭ细胞系（Ｕ２６６、ＲＰＭＩ８２２６）与ＭＭ患者骨髓细胞表达水平明显高逡逑于正常人骨髓单个核细胞（图１）。逡逑１６逡逑

２．２测序结果逡逑将所构建的三条ＮＵＰＲｌ－ｓｈＲＮＡ－ＬＶ阳性克隆重组体进行测序检测，测序结果逡逑显示载体序列构建成功，无序列突变（图２）。逡逑２？０逦２１＿逦２２０逦２３０逦２？＿逦ＺＳＯ逦２？０逦２７＊逡逑ＡＣ邋ＧＡ邋ＡＡＣＡＣＣ邋Ｇ邋Ｇ邋ｋ邋ＡＧ邋Ａ邋ＡＡＧＣＴＡＣＡＣ邋Ａ邋ｌ邋Ｇ邋ＡＪ．ＡＣＴＣ邋ＴＣＧ邋ＡＧ邋ＡＧＴＴＴＣＴＴＣＴＧＴＡＧＣＴ邋ＴＴＣＴＴＴ邋ＴＴＴＴＧＡＡＴＴＣＧ邋Ｇ逡逑ｋｉｈＳｉｉｋＵｉｌｌＫｋ逡逑＾ｋｉｋＣｋＣＣＣＣＧｋＣＣｋｋｅＣＴ邋Ｃ邋Ｃ＊邋１Ｃ邋１ＡＴＴＣＡ邋Ｃ邋ｉ邋ＣＴＣ６邋＊ＧＴＣ邋Ｔ邋Ｃ＊＊邋ｉ邋Ｔ邋Ｔ邋Ｃ邋Ｔ邋Ｃ邋Ｃ邋ｋＣ邋ＣＴＴＣ６ＴＣＴ邋Ｔ邋Ｔ邋ＴＴ６ＡＡＴＴＣ邋ＯＣＡ邋Ｔ逡逑ＡＡＡＣＡＣＣＯＧＯＡＧＧ邋ＡＡＡＣＴＯＣＴＯＡＣＣＡＡＧＣＴＣＴＣＯＡＧ＆ＯＣＴＴＧＯＴＣＡＧＣＡＧＴＴＴＣＣＴＣＴＴＴＴＴＯＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣ逡逑图２阳性克隆测序结果逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２邋Ｐｏｓｉｔｉｖｅ邋ｃ
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R733.3

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本文编号：2682047