基于miRNA介导的CLCF1基因翻译调控功能探讨绝经后骨质疏松症肾阴虚证分子机制

发布时间：2020-05-26 16:42

【摘要】：目的利用生物信息学和双荧光素酶实验筛选、验证靶向调控绝经后骨质疏松症肾阴虚证关联基因CLCF1的microRNA(miRNAs),并对筛选出的miRNAs进行体内验证,旨在miRNAs调节水平探索绝经后骨质疏松症肾阴虚证的分子实质。方法1.microRNA筛选:①用生物信息学软件根据碱基互补配对原则预测与目的基因CLCF1基因3'非编码区(3'Non encoding area,3'UTR)存在互补作用的miRN As;②对生物信息学筛选出的miRNAs,用双荧光素酶进行实验验证其与CLCF1的靶向调控关系。2.miR-655的体内验证:①随机选取福州汉族绝经后女性进行问卷调查,并根据《中医虚证辨证参考标准》和《中国人骨质疏松症诊断标准专家共识》及双能X线骨密度仪对实验对象进行筛选,共筛选出131例,并分组:PMOP肾阴虚证组50例、PMOP肾阳虚证组33例、健康对照组48例;②利用qRT-PCR和we stern blot技术检测三组hsa-miR-655、CLCF1mRNA及蛋白表达水平,研究hsa-miR-655与PMOP肾阴虚证的相关性。结果1.microRNA 筛选和验证结果:①CLCF1 的靶标 miRNAs:TargetScan 44 个,miRanda 21 个,microrna 27 个,三者的交集共有 5 个:hsa-miR-655、hsa-miR-300、hsa-miR-381、hsa-miR-374c、hsa-miR-515;②用双荧光素酶对筛选出的 5个靶标miRNAs进行的实验验证,筛选出表达差异性最显著的一组,后续做进一步的实验分析。实验结果显示:与对照组相比较,hsa-miR-655组荧光活性下调至33.09%,(P=0.001),对CLCF1 3'UTR的基因表达水平抑制作用最为显著;hsa-miR-655与CLCF1 3'UTR结合位点发生突变后,荧光活性上调至67.22%,提示CLCF1 3'UTR的基因表达水平受hsa-miR-655特异性的抑制作用。实验结果表明:CLCF1基因的3'UTR能够与hsa-miR-655发生特异性结合,特异性的抑制CLCF 1基因的表达。2.hsa-miR-655与PMOP肾阴虚证相关性实验研究:(①三组实验研究对象一般资料年龄、绝经年龄、BMI进行统计学比较,三组一般资料差异无统计学意义;②用2-△△Ct法对三组的CLCF1 mRNA和has-miR-655表达水平进行相对定量分析:PMOP肾阴虚证组CLCF1 mRNA表达量明显低于健康对照组,P0.01,比较有显著性统计学意义;PMOP肾阴虚证组has-miR-655表达水平显著高于健康对照组(P0.01),统计学有显著性差异;PMOP肾阴虚证组与PMOP肾阳虚证组的CLCF1 mRNA和has-miR-655表达水平比较无显著性差异(P0.05);③用wester blot法检测三组CLCF1蛋白的表达情况:健康对照组:0.564±0.158,P MOP肾阴虚证组:0.325±0.125,PMOP肾阳虚证组:0.474±0.178,PMOP肾阴虚证组CLCF1蛋白表达水平明显低于健康对照组,P0.01,比较有显著的统计学意义;PMOM肾阴虚证组与PMOP肾阳虚证组比较无显著性差异(P0.05)。结论Hsa-miR-655能够通过靶向结合CLCF1 mRNA的3'UTR区,在转录后水平负性调控绝经后骨质疏松症肾阴虚证。
【学位授予单位】：福建中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R259

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本文编号：2682124