【摘要】：目的:结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)的发病率目前在欧美发达国家已经开始明显下降,但我国结直肠癌发病率仍然呈逐年缓慢上升趋势,而且进展期结直肠癌病人的远期疗效仍不能让人满意。因此探索结直肠癌的发病机制,寻找与结直肠癌发生、发展以及恶性生物学行为关系紧密的分子,作为早期诊断和靶向治疗的标记物,提高早诊率并延长患者生存时间对于临床医生显得极为迫切。细胞的失控性异常增殖是导致肿瘤发生的一个重要前提,其本质是细胞原癌基因的激活和抑癌基因的失活。B细胞转位基因3(B-cell translocation gene 3,BTG3)作为抗增殖基因家族成员之一,在参与细胞DNA损伤修复、维持基因组稳定性、诱导基因组异常细胞衰老等方面发挥重要作用。BTG3在人类正常组织中广泛高表达,但在许多人类恶性肿瘤中均发现BTG3过度低表达,而且沉默BTG3基因后可使癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力增强,凋亡能力减弱。由此推测,BTG3可能是一个潜在的抑癌基因。但是BTG3在结直肠癌发生发展、恶性表型以及临床和预后价值方面的作用尚不明确。本课题拟对BTG3在结直肠癌发生发展中的作用以及调控肿瘤恶性生物学行为的分子机制进行研究。研究方法:1、收集140例行结直肠癌手术患者的癌组织和距癌旁5cm正常结直肠组织(经病理切片证实未发现癌细胞)。应用免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)染色方法比较结直肠癌组织和配对癌旁正常组织中BTG3的表达差异,通过t检验或方差分析研究BTG3异常表达与结直肠癌病人临床病理特征之间的关系。Kaplan-Meier法分析BTG3表达与患者总生存率(Overall survival,OS)和无病生存率(Disease-free survival,DFS)之间的关系,Cox回归模型对影响总生存率和无病生存率的临床病理因素行单因素及多因素分析。构建ROC曲线评价BTG3对结直肠癌的诊断价值。2、筛选BTG3相对高表达的结直肠癌细胞系,通过慢病毒感染细胞下调BTG3基因表达并构建稳转细胞系,应用Real-time PCR和Western blot检测BTG3mRNA和蛋白水平变化以评估基因敲减效率。CCK-8法检测下调BTG3基因对细胞增殖能力的影响;碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)染色检测下调BTG3基因对细胞周期的影响;AnnexinV-PE/7-AAD双染法检测下调BTG3基因对细胞早期凋亡的影响;Transwell实验检测下调BTG3基因对细胞迁移和侵袭能力的影响。3、采用Affymetrix基因芯片检测结直肠癌细胞BTG3表达下调后人基因组表达谱的变化,用生物信息分析软件IPA(Ingenuity Pathway Analysis)对差异性显著的基因,进行疾病与功能分类以及经典信号通路的富集分析。Western blot检测部分候选下游通路差异基因蛋白表达量,以验证IPA生物信息分析结果的可靠性并揭示BTG3在结直肠癌中发挥生物学功能的可能分子机制。结果:1、IHC结果显示癌组织中BTG3阳性表达的平均光密度(mean optical density,MOD)平均值为0.267,显著低于癌旁正常结直肠组织MOD平均值0.295(P0.001)。BTG3异常表达与肿瘤分化程度(P=0.037)、肿瘤侵润深度(P=0.016)、肿瘤远处转移(P=0.024)和肿瘤TNM分期(P=0.007)相关;与结直肠癌病人性别、年龄、肿瘤位置、淋巴结转移、血管或神经侵犯无显著相关性(P0.05)。BTG3相对高表达的结直肠癌患者其OS和DFS均较BTG3相对低表达患者明显增高(OS P=0.0045;DFS P=0.0011)。BTG3表达情况是影响结直肠癌患者OS和DFS的独立预后因素(OS P=0.016;DFS P=0.005)。BTG3对结直肠癌诊断具有一定的参考价值,ROC曲线下面积为0.638(P0.0001)。2、BTG3蛋白在HCT116和LoVo细胞株中相对高水平表达。慢病毒成功感染上述两种细胞后能显著下调BTG3的mRNA和蛋白表达水平(P均0.05)。CCK8法检测下调BTG3基因对细胞增殖能力的影响:HCT116和LoVo细胞中敲减组(shRNA1和sh RNA2)比对照组(NC)细胞增殖能力明显增强。HCT116细胞,48h细胞增殖倍数shRNA1组和sh RNA2组均比NC组增高(4.022±0.419 vs2.279±0.054 P0.0001;3.323±0.207 vs 2.279±0.054 P=0.0008),72h细胞增殖倍数shRNA1组和sh RNA2组均比NC组增高(8.993±1.043 vs 4.649±0.078P0.0001;7.667±0.246 vs 4.649±0.078 P0.0001),96h细胞增殖倍数shRNA1组和shRNA2组均比NC组增高(12.71±1.732 vs 6.736±1.601 P0.0001;12.04±0.530 vs 6.736±1.601 P0.0001);LoVo细胞,48h细胞增殖倍数shRNA1组和shRNA2组均比NC组增高,但无统计学差异(3.002±0.425 vs 2.588±0.505P=0.2949;2.837±0.036 vs 2.588±0.505 P=0.6167),72h细胞增殖倍数shRNA1组和shRNA2组均比NC组增高(5.984±0.220 vs 5.232±0.109 P0.0001;5.612±0.036vs 5.232±0.109 P=0.0091),96h细胞增殖倍数shRNA1组和shRNA2组均比NC组增高(9.287±0.381 vs 7.527±0.139 P0.0001;8.374±0.274 vs 7.527±0.139 P=0.0044);PI单染法检测下调BTG3基因对细胞周期的影响:HCT116细胞,G1期细胞shRNA1组比NC组细胞增多(75.105±2.586 vs 61.357±2.525P=0.0002),shRNA2组比NC组细胞增多但无统计学差异(64.777±3.867 vs61.357±2.525 P=0.431);S期细胞shRNA1组和shRNA2组比NC组变化不明显(14.910±3.929 vs 17.383±4.381)(21.010±4.259 vs 17.383±4.381)(P均0.05);G2期细胞shRNA1组比NC组细胞减少(9.985±3.617 vs 21.257±2.020P=0.0016),shRNA2组比NC组细胞减少(14.180±0.625 vs 21.257±2.020P=0.0435);LoVo细胞,G1期细胞shRNA1组比NC组细胞减少(54.767±2.778vs 63.153±3.199 P=0.0139),shRNA2组比NC组细胞减少但无统计学差异(59.300±4.859 vs 63.153±3.199 P=0.3342);S期细胞shRNA1组比NC组细胞增加(32.457±2.457 vs 14.877±4.351 P0.0001),shRNA2组比NC组细胞增加(26.717±5.061 vs 14.877±4.351 P=0.0008);G 2期细胞shRNA1组比NC组细胞减少(12.777±0.601 vs 21.970±1.304 P=0.0072),shRNA2组比NC组细胞减少(13.983±0.466 vs 21.970±1.304 P=0.0192)。由此说明下调BTG3通过减少G2期阻滞促进HCT116细胞增殖;下调BTG3通过增加S期DNA合成并减少G2期阻滞促进LoVo细胞增殖。AnnexinV-PE/7-AAD双染法检测下调BTG3基因对细胞早期凋亡的影响:HCT116细胞,shRNA1组比NC组细胞凋亡率降低(8.627±4.307 vs 23.117±4.737 P=0.0065),shRNA2组比NC组细胞凋亡率降低(13.890±1.154 vs 23.117±4.737 P=0.0469);LoVo细胞,shRNA1组比NC组细胞凋亡率降低(0.713±0.268 vs 4.783±1.590 P=0.0034),shRNA2组比NC组细胞凋亡率降低(2.283±0.284 vs 4.783±1.590 P=0.0311),说明沉默BTG3基因能抑制结直肠癌细胞凋亡。Transwell实验检测下调BTG3基因对细胞迁移的影响,HCT116细胞,shRNA1组比NC组迁移细胞增多(186±8 vs 55±7 P0.0001),shRNA2组比NC组迁移细胞增多(147±8 vs 55±7 P0.0001);LoVo细胞,shRNA1组比NC组迁移细胞增多(124±12 vs 74±6 P0.0001),shRNA2组比NC组迁移细胞增多(98±7 vs 74±6 P=0.0156);对侵袭能力的影响,HCT116细胞,shRNA1组比NC组侵袭细胞增多(130±5 vs 36±6 P0.0001),shRNA2组比NC组侵袭细胞增多(92±8 vs 36±6 P0.0001);LoVo细胞,shRNA1组比NC组侵袭细胞增多(106±7 vs 47±8 P0.0001),shRNA2组比NC组侵袭细胞增多(85±8 vs 47±8 P0.0001);说明下调BTG3基因增强细胞迁移和转移的能力。3、BTG3表达下调后基因表达谱芯片筛选出差异表达基因554个,其中上调基因281个,下调基因273个。差异基因主要在涉及细胞形态、细胞学功能、细胞周期、凋亡以及肿瘤形成、肿瘤细胞的死亡、增殖等方面发挥作用。差异基因主要影响包括ERK/MAPK通路在内的多个经典信号通路的状态。Western blot验证涉及ERK/MAPK通路的9个差异基因的蛋白表达情况,上调的有PAK2、YWHAB、RPS6KA5和STAT3;下调的有RAP1A、DUSP6和STAT1;无变化的是cFOS和ATF4。蛋白改变总体趋势与基因芯片分析结果一致。结论:1、BTG3在结直肠癌中的表达显著低于临癌正常组织,并且与与肿瘤分化程度、侵润深度、远处转移和TNM分期密切相关,BTG3在结直肠癌的发生发展中发挥肿瘤抑制作用;BTG3可作为一项独立判断结直肠患者预后的指标;BTG3对结直肠癌的诊断具有一定参考价值。2、下调BTG3基因能显著增强结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭能力,同时能抑制细胞凋亡和细胞周期阻滞。下调BTG3表达在促进结直肠癌恶性表型方面发挥重要作用。3、BTG3基因参与调节ERK/MAPK通路中若干分子的表达是其在结直肠癌细胞中发挥生物学功能的可能的分子机制。
【图文】：
图1.2 140例结直肠癌患者的Kaplan-Meier生存分析结果A：BTG对总生存率OS的影响； B：BTG对无病生存率DFS的影响。表1.2 总生存率和无病生存率的单因素与多因素分析
分子标志物，我们利用结直肠癌组织和配对临癌正常结直肠组织的BTG3相对表达水平构建了ROC曲线。我们的结果发现ROC曲线下面积(area under the cure，，AUC)为0.638(P<0.0001，图1.3)，说明BTG3对结直肠癌患者可能具有一定的诊断能力，是一个潜在的诊断标志物。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.34
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2682808
