荷载SATB1基因shRNA的溶瘤腺病毒治疗前列腺癌

发布时间：2020-05-27 07:54

【摘要】：第一部分荷载SATB1基因sh RNA溶瘤腺病毒对前列腺癌的靶向治疗作用目的:观察荷载SATB1基因sh RNA溶瘤腺病毒(ZD55-SATB1)体内外对前列腺癌的靶向治疗作用。方法:结晶紫染色、CCK8法观察ZD55-SATB1对前列腺癌细胞的毒性作用和增殖抑制效果。RT-PCR评价ZD55-SATB1对前列腺癌细胞SATB1基因的m RNA表达的沉默作用;Western Blot检测ZD55-SATB1对前列腺癌细胞SATB1蛋白及E1A表达的影响;Transwell研究ZD55-SATB1对前列腺癌细胞侵袭的影响;构建荷载前列腺癌DU145细胞的裸鼠皮下移植瘤模型。随机分成4组,每组6只,分别用ZD55-SATB1、ZD55-EGFP、Ad-SATB1、PBS瘤内注射治疗,100μl病毒(5×108 pfu),隔天一次,共三次。每周测量肿瘤体积,绘制肿瘤时间-体积生长曲线。第49天,全部处死裸鼠,免疫组化检测各组SATB1表达水平;TUNEL评价肿瘤组织细胞的凋亡情况。取肝、肺脏组织HE染色观察肿瘤转移情况。结果1.结晶紫染色结果:病毒ZD55-SATB1、ZD55-EGFP、Ad-SATB1对前列腺癌细胞均有杀伤作用,且随着病毒浓度的增大毒性作用逐渐增强,其中ZD55-SATB1的杀伤作用最强;ZD55-SATB1的细胞病变效应(CPE)比ZD55-EGFP、Ad-SATB1显著,而在正常细胞PZ-HPV-7中,在100MOI时ZD55-SATB1才出现CPE,提示ZD55-SATB1介导的细胞毒性具有肿瘤靶向性。2.CCK-8结果:随着病毒感染时间延长,前列腺癌细胞的存活率均逐渐下降。ZD55-SATB1对前列腺癌细胞杀伤作用,强于ZD55-EGFP、Ad-SATB1;感染96h后,ZD55-SATB1组DU145、LNCa P细胞存活率分别为(31.6±3.31%,36.6±3.63%),ZD55-EGFP组为(61.7±2.42%,65.4±2.324%),Ad-SATB1组为(82.4±3.54%,86.4±4.18%),ZD55-SATB1细胞存活率明显降低,与其他两组比较差异有统计学意义(P0.05),而正常细胞PZ-HPV-7细胞感染病毒后,存活率却未出现明显变化。3.RT-PCR结果:ZD55-SATB1和Ad-SATB1均能特异沉默DU145、LNCa P细胞SATB1基因,分别为(36.5±3.1%、43.1±4.2%)和(51.9±3.2%、64.3±4.1%),与ZD55-EGFP和PBS对照组相比,差异有统计学意义(P0.01),表明ZD55-SATB1特异性沉默SATB1基因的表达,且比Ad-SATB1沉默效果进一步提高。4.Western Blot结果显示:ZD55-SATB1和Ad-SATB1组DU145细胞中SATB1蛋白相对表达量分别为PBS组的(40.1±3.7%,61.9±3.4%),LNCa P细胞中两组分别为对照组的(45.9±3.2%,67.1±3.7%),差异有统计学意义(P0.05),而ZD55-EGFP对SATB1蛋白表达水平基本无影响,证实ZD55-SATB1可以有效地沉默前列腺癌细胞中SATB1基因蛋白的表达。ZD55-SATB1、ZD55-EGFP组E1A蛋白表达水平在前列腺癌细胞DU145和LNCa P中显著高于Ad-SATB1,表明ZD55-SATB1、ZD55-EGFP可在前列腺癌细胞中高效复制。另外,ZD55-SATB1、ZD55-EGFP在人正常前列腺上皮细胞PZ-HPV-7几乎不表达E1A,进一步说明ZD55-SATB1具有肿瘤靶向性。5.Transwell细胞侵袭实验结果:ZD55-SATB1组DU145和LNCa P穿过的细胞数分别为(61.3±17.25和25.4±6.2),明显少于Ad-SATB1组(170.1±25.44和42.7±10.7)及ZD55-EGFP组(295.4±23.36和77.6±15.2),各组比较差异有统计学意义(P0.05),表明ZD55-SATB1可有效抑制前列腺癌细胞的侵袭。6.移植瘤:ZD55-SATB1组肿瘤平均体积为(295.3±51.9)mm3,比ZD55-EGFP组(525.6±89.3)mm3、Ad-SATB1组(582.3±97.0)mm3和PBS组(777.1±139.8)mm3显著减小,ZD55-SATB1组与各组比较差异有统计学意义(P0.05),提示ZD55-SATB1对前列腺移植瘤的生长抑制效果比ZD55-EGFP、Ad-SATB1组明显增强。7.肺组织HE染色结果显示:PBS组有8只裸鼠出现肿瘤肺转移,同时ZD55-EGFP组有2只出现转移,而ZD55-SATB1和Ad-SATB1组则没有出现转移,提示ZD55-SATB1可抑制前列腺癌的远处转移。8.TUNEL实验结果:ZD55-SATB1组凋亡阳性细胞率为(87.3±4.8)%,ZD55-EGFP组为(51.2±3.4)%,Ad-SATB1组为(41.3±3.2)%,PBS组为(20.1±1.9)%,ZD55-SATB1组凋亡率显著增高,差异有统计学意义(P0.05),说明ZD55-SATB1可促进移植瘤细胞的凋亡。结论:成功构建了新型溶瘤腺病毒ZD55-SATB1,通过体外实验证实ZD55-SATB1可以在前列腺癌细胞中特异性增殖,干扰SATB1基因的表达;ZD55-SATB1在体外对前列腺癌细胞具有较好杀伤、增殖抑制作用及抑制前列腺癌细胞侵袭作用;ZD55-SATB1可以有效抑制人前列腺癌裸鼠移植瘤的生长和转移、促进其凋亡,为前列腺癌的生物与基因治疗奠定了基础。第二部分荷载SATB1基因sh RNA溶瘤腺病毒联合内分泌、化疗治疗激素敏感性前列腺癌目的:观察荷载SATB1基因sh RNA溶瘤腺病毒(ZD55-SATB1)联合内分泌、化疗对激素敏感性前列腺癌的治疗作用。方法:1.CCK8法观察对激素敏感性前列腺癌LNCa P细胞的毒性作用和增殖抑制效果。2.Hoechst-33258染色、TUNEL检测前列腺癌LNCa P细胞凋亡情况。3.Migration检测前列腺癌LNCa P细胞的迁移。4.Invasion检测前列腺癌LNCa P细胞的侵袭。5.Western blot检测SATB1及凋亡相关蛋白Bcl-2,caspase-3和caspase-8的表达。6.构建裸鼠前列腺癌LNCa P细胞皮下移植瘤模型,随机分成8组:空白对照组(PBS组)、内分泌治疗组(ET组:手术去势)、药物治疗组(DTX组)、病毒治疗组(ZD55-SATB1组)、内分泌治疗联合化疗组(ET+DTX组)、病毒联合内分泌治疗组(ZD55-SATB1+ET组)、病毒联合化疗组(ZD55-SATB1+DTX组)、病毒联合化疗及内分泌治疗组(ET+DTX+ZD55-SATB1组)。7.测量肿瘤体积,绘制肿瘤时间-体积生长曲线。8.HE染色观察肿瘤细胞的生长。9.免疫组化检测肿瘤组织中caspase-3、caspase-8、Bcl-2和CD31蛋白的表达。结果:1.CCK-8结果:5.0MOI的病毒ZD55-SATB1联合1ng/ml的DTX、10MOI的ZD55-SATB1、10MOI的ZD55-EGFP、2ng/ml的DTX、100ng/ml的Sitelong和PBS分别作用LNCa P细胞,48h后的存活率分别为(37.61±2.17)%、(65.32±5.06)%、(72.25±3.40)%、(55.94±3.97)%、(89.67±4.62)%、(81.17±2.19)%。ZD55-SATB1联合DTX组分别与单用ZD55-SATB1组、ZD55-EGFP组、DTX组、Sitelong组和PBS组比较,差异有统计学意义(P0.05)。ZD55-SATB1联合DTX组与Sitelong组比较,对LNCa P细胞增殖的抑制作用更明显,差异有统计学意义(P0.05),说明ZD55-SATB1联合DTX及去除十一酸睾酮的联合,对细胞增殖抑制作用较仅病毒联合化疗进一步增强。2.Hoechst33258结果:5.0MOI的病毒ZD55-SATB1联合1ng/ml的DTX、10MOI的ZD55-SATB1、10MOI的ZD55-EGFP、2ng/ml的DTX、100ng/ml的Sitelong和PBS组凋亡率(%)分别为:64.00±6.52、52.67±8.14、33.33±3.59、36.52±7.84、5.71±2.26和6.01±4.64,联合组与单一治疗组比较,差异有统计学意义(P0.05),说明联合治疗具有较强的促凋亡作用。3.Migration实验结果:5.0MOI的病毒ZD55-SATB1联合1ng/ml的DTX、10MOI的ZD55-SATB1、10MOI的ZD55-EGFP、2ng/ml的DTX、100ng/ml的Sitelong和PBS分别作用LNCa P细胞,培养24h后,穿膜细胞数分别为27.23±7.14、35.10±2.38、40.31±2.59、68.46±3.58、118.01±5.64和106.24±10.35,联合组与单一治疗组比较,迁移细胞明显减少,差异具有统计学有意义(P0.01)。4.Invasion实验结果:5.0MOI的病毒ZD55-SATB1联合1ng/ml的DTX、10MOI的ZD55-SATB1、10MOI的ZD55-EGFP、2ng/ml的DTX、100ng/ml的Sitelong和PBS分别作用LNCa P细胞,培养24h后计算穿膜细胞数分别为12.31±0.41、21.93±2.11、26.12±2.13、25.06±1.89、76.82±4.31和68.62±4.22,联合组与其它各组比较,差异具有统计学有意义(P0.01)5.TUNEL实验结果:5.0MOI的病毒ZD55-SATB1联合1ng/ml的DTX、10MOI的ZD55-SATB1、10MOI的ZD55-EGFP、2ng/ml的DTX、100ng/ml的Sitelong和PBS处理48h后,各组的凋亡率分别为(31.13±6.88)%、(14.70±3.84)%、(12.29±5.26)%、(13.802±4.74)%、(4.36±2.23)%、(9.48±3.19)%。联合组多于单一治疗组,与PBS组相比,差异均具有统计学意义(P0.05)。6.Western blot实验结果:5.0MOI的ZD55-SATB1联合1.0ng/m L的DTX、10.0MOI的ZD55-SATB1、10.0 MOI的ZD55-EGFP、2.0ng/m L的DTX、100.0 ng/m L的Sitelong组、PBS组SATB1蛋白的相对表达量分别为5.35±1.49、12.73±7.80、29.02±3.54、45.37±3.76、80.03±4.02、和91.72±4.45,联合组SATB1蛋白的表达量较其它各组明显减低(P0.05),说明腺病毒ZD55-SATB1联合DTX可明显抑制SATB1蛋白的表达且DTX不影响ZD55-SATB1的沉默效果。ZD55-SATB1组与其它单一治疗组比较,SATB1蛋白的表达量差异亦有统计学意义(P0.05),表明ZD55-SATB1可有效沉默SATB1基因,抑制SATB1蛋白的表达。各治疗组Bcl-2的表达量显著降低,caspase-3和caspase-8的表达量均增多,与单药物治疗组相比,联合组对凋亡蛋白的影响更为显著(P0.05),7.移植瘤体积:病毒联合化疗及内分泌治疗组、病毒联合化疗组、内分泌治疗联合化疗组、病毒联合内分泌治疗组、病毒治疗组、化疗组、内分泌治疗组和空白对照组移植瘤终体积分别为264.92±28.88、555.64±254.89、555.64±254.89、1589.47±300.91、787.52±221.15、1127.25±271.93、1679.58±258.82、2287.41±254.89和2602.13±325.74。病毒联合化疗及内分泌治疗组疗效最强,显著小于空白对照组以及单药治疗组,差异有统计学意义(P0.05)。8.HE染色:内分泌治疗组、化疗组、病毒治疗组、病毒联合内分泌治疗组、内分泌治疗联合化疗组、病毒联合化疗组、病毒联合化疗及内分泌治疗组的肿瘤组织中均可见较多的死细胞,细胞裂解成碎片,细胞核固缩碎裂,其正常的组织结构消失,但联合组的肿瘤细胞坏死更明显。9.免疫组化法检测肿瘤组织中caspase-3、caspase-8、Bcl-2和CD31蛋白的表达:联合组与单用药物或病毒组相比,caspase-3、caspase-8蛋白表达量增多,Bcl-2蛋白表达量降低,差异有统计学意义(P0.05)。另一方面,与单用药物或病毒组相比,联合组移植瘤组织中CD31蛋白的表达量显著降低,说明联合组能够有效促进促凋亡蛋白的表达,降低抑凋亡蛋白的表达,且能在一定程度上抑制肿瘤组织血管的生成。结论:1.体外实验表明:溶瘤腺病毒和多西他赛对前列腺癌LNCa P细胞均有杀伤作用,体外给予Sitelong可促进LNCa P细胞的增殖。同时,溶瘤腺病毒联合多西他赛及去雄激素治疗可协同发挥抗肿瘤效果。2.体内实验表明:溶瘤腺病毒、多西他赛和手术去势均抑制前列腺癌LNCa P细胞皮下移植瘤的生长,且联合效果优于单一用药,其可能的机制包括抑制肿瘤细胞生长、诱导凋亡、抑制血管生成。
【图文】：

过表达,基因,侵袭力,靶向治疗

荷载 SATB1 基因 shRNA 的溶瘤腺病毒靶向治疗前表达最低，侵袭力亦最弱，进一步研究发现，有效沉默 SATB1 基因细胞株的侵袭力显著降低；同时，高效表达 SATB1 基因后，LNCaP 细著增强，，进一步证实 SATB1 基因在前列腺癌发生和转移过程中发挥重能是前列腺癌治疗的理想靶点，以上研究发表在 J Transl Med. (2013 ,IF 3.99)[18-19]。
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.25

【参考文献】