miR-24-3p和miR-21-5p分别调控靶基因SOX7和TGFBI影响肺癌进程

发布时间：2020-05-28 14:33

【摘要】：据最新的全球癌症统计显示,肺癌位居世界癌症发病率与致死率的第一位。近几十年来,虽然关于肺癌的研究已经很多,并且设计产生了很多新型的靶向药物。但由于肺癌的发病机制十分复杂,病人的五年存活率仍然低于15%。因此,对肺癌的机制进行进一步研究将有助于发现新的有效治疗措施。微小RNA(microRNA,miRNAs)是长度为18-25bp左右的核苷酸,最近的研究表明miRNAs在人类多种癌症的发展进程中起到了重要作用,关于其在肿瘤中的作用机制研究是癌症研究领域的一个热点。目前,有关miR-24-3p在肺癌中的功能还存在争论,有报道显示miR-24-3p在肺癌中可以起到促癌miRNA作用,也有报道显示miR-24-3p在肺癌中发挥抑癌miRNA的作用,因此开展进一步研究有望为miR-24-3p在肺癌中的具体功能提供新的证据。miR-21-5p在肺癌中高表达可以作为肺癌诊断的生物标志物之一,且其对抑制肺癌细胞的放化疗敏感性也起到了重要作用,而miR-21-5p在肺癌中具体的作用机制研究还很少,开展进一步研究非常必要。本研究以肺癌为研究对象,分别探讨肺癌中miR-24-3p和miR-21-5p是如何通过调控各自的靶基因(SOX7和TGFBI)进而影响肺癌进程。本研究内容分二个部分。第一部分是研究miR-24-3p在肺癌中的功能及其作用机制。本研究首先检测了A549、H1299及一种正常肺上皮细胞(HLF)中miR-24-3p的表达水平,结果表明A549中miR-24-3p的表达量明显高于正常肺上皮细胞(P0.001),因此本研究使用A549做为细胞功能实验的细胞株。采用细胞转染技术过表达或抑制miR-24-3p在A549细胞内的表达水平,通过细胞迁移、细胞增殖实验在细胞水平研究miR-24-3p对肺癌细胞生物学功能的影响。结果表明:与空白对照组相比,miR-24-3p过表达后,A549的相对细胞数上升了近20%(P0.05);其迁移细胞数上升了近260%(P0.001)。而抑制了 miR-24-3p的表达后,A549的相对细胞数降低了近22%(P0.01);其迁移细胞数降低了近50%(P0.01)。其次通过生物信息学软件(targetscan、miRanda、PicTc),预测出了 SOX7基因可能是miR-24-3p的靶基因;为了验证二者之间的调控关系,进行了双荧光素酶报告基因实验,结果表明:miR-24-3p可以结合在SOX7基因mRNA的3'-UTR区域;通过TCGA数据库检索发现,肺癌中SOX7蛋白表达量相对于正常组织都发生了显著的下调。为了进一步探讨SOX7蛋白表达量下降可能的调控机制,同时将miR-24-3p的过表达及干扰模拟物转染进入了二种肺癌细胞系(A549、H1299),通过westerblot实验检测SOX7蛋白的表达水平,结果表明:与空白对照组相比,miR-24-3p过表达后,二种肺癌细胞系中SOX7蛋白的表达量下降了近30%(P0.05);而抑制了 miR-24-3p的表达后,二种肺癌细胞系中SOX7蛋白的表达量上升了近25%(P0.05)。采用qRT-PCR实验检测了SOX7 基因mRNA的表达情况,结果表明,过表达及干扰miR-24-3p后,SOX7基因的mRNA表达水平没有发生任何变化,此提示miR-24-3p在转录后水平调控了 SOX7基因的表达,这一结果也符合miRNA调控基因表达的机制。为了研究miR-24-3p调控SOX7基因的表达对肺癌细胞功能的影响,本研究在A549细胞中干预了 SOX7基因的表达,过表达SOX7基因后与空白对照组相比,A549的相对细胞数降低了近40%(P0.001);其迁移细胞数下降了近60%(P0.01);与空白对照组相比,抑制了 SOX7蛋白表达后,A549的相对细胞数上升了近36%(P0.01);其迁移细胞数上升了近300%(P0.01)。以上结果表明:miR-24-3p与SOX7基因对肺癌细胞增殖及迁移的存在相反的调控关系。为了进一步阐明miR-24-3p通过调控SOX7基因的表达影响了肺癌细胞的增殖及迁移,还进行了挽救实验。结果表明:当SOX7蛋白过表达时,可以减小miR-24-3p对肺癌细胞增殖及迁移的影响,进一步表明miR-24-3p是通过抑制SOX7基因的表达促进肺癌细胞的增殖及迁移。最后,采用慢病毒质粒构建miR-24-3p过表达细胞系,通过移植瘤模型验证miR-24-3p对于肺癌肿瘤生成的影响。体内移植瘤模型结果显示:过表达miR-24-3p后肿瘤的生长受到促进;而过表达SOX7蛋白后,肿瘤的生长明显被抑制。而同时过表达SOX7蛋白与miR-24-3p后,肿瘤的生长明显慢于单独过表达miR-24-3p组,且SOX7蛋白的表达量介于对照组与单独过表达miR-24-3p组之间,提示SOX7减小miR-24-3p对肿瘤生长的促进作用。第二部分研究了 miR-21-5p对TGFBI基因的调控。首先,本研究通过TCGA数据库检索发现,肺癌中miR-21-5p表达量相对于正常组织发生了显著的上升(P0.001)。为了更好的探讨miR-21-5p表达量改变可能对肺癌细胞功能的影响,本研究进行了细胞增殖实验。结果表明:与空白对照组相比,miR-21-5p过表达后,肺癌细胞的相对细胞数上升了近20%(P0.01),而抑制了 miR-21-5p的表达后,A549的相对细胞数降低了近30%(P0.05)。以上结果表明:miR-21-5p促进了肺癌细胞的增殖。本研究通过生物信息学软件(targetscan、miRanda、PicTc),预测出了 miR-21-5p可能调节TGFBI基因的表达。为了验证二者之间的调控关系,首先进行了双荧光素酶报告基因实验,结果表明:miR-21-5p可以结合在TGFBI基因mRNA的3'-UTR区域;同时在二种肺癌细胞系(A549、H1299)干预miR-21-5p的表达,通过western blot实验检测TGFBI蛋白的表达水平,结果表明:与空白对照组相比,miR-21-5p过表达后,A549细胞中TGFBI蛋白的表达量下降了近30%(P0.05),H1299细胞中TGFBI蛋白的表达量下降了近50%(P0.05);而抑制了 miR-21-5p的表达后,A549细胞中TGFBI蛋白的表达量上升了近30%(P0.05),H1299细胞中TGFBI蛋白的表达量上升了近60%(P0.01)。上述结果表明:miR-21-5p在肺癌细胞中可以调控TGFB1基因的表达。为了研究miR-21-5p促进肺癌细胞的增殖是由于其调控TGFB1基因的表达而实现的,采用细胞转染技术干预TGFBI基因在肺癌细胞中的表达水平,通过CCK-8实验及EdU实验在细胞水平研究TGFB对肺癌细胞增殖的影响。结果表明:过表达TGFBI基因后与空白对照组相比,肺癌细胞的相对细胞数降低了近30%(P0.05),抑制了 TGFBI蛋白表达后,肺癌细胞的相对细胞数上升了近60%(P0.05)。为了进一步阐明miR-21-5p通过调控TGFBI基因的表达影响了肺癌细胞的增殖,并进行了挽救实验。结果表明:当TGFBI蛋白过表达时,可以减小miR-21-5p对肺癌细胞增殖的影响,提示miR-21-5p在体外可以通过抑制TGFBI基因的表达促进肺癌细胞的增殖。综上所述,本研究发现miR-24-3p促进了肺癌细胞的增殖与迁移,并发现miR-24-3p通过作用于SOX7基因发挥其促癌miRNA的功能,该研究成果为miR-24-3p在肺癌中发挥促癌miRNA作用提供了新的证据;并发现miR-21-5p通过作用于TGFB1基因促进了肺癌细胞的增殖,揭示了 miR-21-5p在肺癌中发挥作用的新机制。本研究发现了 miR-24-3p和miR-21-5p分别调控靶基因SOX7和TGFBI对肺癌进程的影响,但它们对肺癌进程影响是否存在叠加效应等尚待进一步研究。
【图文】：

图１．１动植物ｍｉＲＮＡｓ生物合成过程（Ｄｕ邋ａｎｄ邋Ｚａｍｏｒｅ，２00５）逡逑Ｆｉｇｕｒｅｌ．ｌ邋Ｔｈｅ邋ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ邋ｏｆ邋ｍｉＲＮＡｓ邋ｉｎ邋ｐｌａｎｔｓ邋ａｎｄ邋ａｎｉｍａｌｓ逡逑２．３邋ｍｉＲＮＡｓ调控基因表达的机制逡逑

图２．１邋ｐＥＸ－３载体示意图逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．１邋ＤＮＡ邋ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｐＥＸ－３逡逑
【学位授予单位】：安徽师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R734.2

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