水稻DGP1基因介导的叶绿体发育与叶绿素合成的分子机理研究

发布时间：2020-05-28 20:00

【摘要】：光合效率是影响水稻产量的重要因素。在本实验室前期研究中,发现一个水稻深绿穗突变体dgp1(dark green panicle1),其穗色和叶色深绿,光合效率显著增高。通过图位克隆技术分离DGP1基因,但是其编码蛋白功能未知。在此基础上,本研究通过RNA-Seq及生物信息学分析,筛选出受DGP1基因调控的下游基因,并利用RT-qPCR和蛋白免疫印迹(Western blot)方法分别检测光合相关基因表达量和蛋白的积累量。然后通过叶绿体自发荧光及电镜切片分析叶绿体发育状况,并对DGP1启动子序列进行转录活性分析。最终阐述DGP1基因介导叶绿体发育与叶绿素合成的分子机理。首先,通过RNA-Seq分析技术和生物信息统计学分析,筛选dgp1突变体相比野生型表达上或下调的基因与过表达相比野生型表达上或下调的基因。两者比较得到190个候选差异表达基因。其中有125个基因的表达量在dgp1中最高、野生型次之、过表达中最低。有65个基因在dgp1中表达量最低、野生型较高,过表达中最高。为了进一步确认候选差异表达基因的功能及参与的生物代谢途径,进行GO分析,发现候选差异基因主要集中在光合、光反应中心、叶绿体、类囊体等光合相关的场所;并进行KEGG分析,发现光合作用有关基因的富集率最高。然后,利用RT-qPCR对筛选出的光合相关基因表达情况进行验证分析,结果28个光合相关基因表达量与RNA-Seq分析结果相同。再利用蛋白免疫印迹检测光合相关蛋白的积累量,发现光合蛋白Lhca1、Lhca3、Lhca4、Lhcb2等在dgp1突变体中蛋白积累量最高,野生型积累量较高,过表达积累量最低。为了研究DGP1基因对叶绿体发育的影响,利用激光共聚焦显微镜成像检测技术观察水稻原生质体形态,发现dgp1突变体中叶绿体数量较多、形态较大,野生型相对较少,过表达中叶绿体数量只有稀少的几个且形态较小。同时叶绿体电镜切片分析发现,dgp1突变体内囊体堆集较厚,野生型内囊体堆集较稀疏,过表达内囊体堆集较薄。在胚芽鞘中,dgp1突变体相比野生型、过表达,较早形成叶绿体。最后,对DGP1启动子片段进行转录活性分析,先对启动子片段进行分段分析。再分别构建分段的DGP1与GFP荧光蛋白融合表达载体,在烟草叶表皮细胞观察绿色荧光,发现DGP1启动子-195至-1352bp具有转录活性。对后续筛选DGP1基因的转录因子奠定基础。综上所述,DGP1基因突变或过表达,导致下游光合相关基因的表达量及蛋白积累量发生显著变化,同时叶绿体发育也受到影响。这些结果对研究DGP1基因的分子机理及植物的高光效育种奠定了基础。
【图文】：

示意图,光合系统,示意图,辅助因子

第一章文献综述逡逑光合系统Ｉ以三聚体和单体形式存在于体内。它的结构己被确定是最复杂的逡逑膜蛋白。ＰＳ邋Ｉ蛋白结构如图１．１所示Ｉ＇最显着的特征是辅助因子约占光合系统逡逑Ｉ总分子量的３０％以上。辅助因子不仅对蛋白质发挥作用起到决定性的作用，逡逑而且在ＰＳ邋Ｉ的组装和结构完整性中起着重要作用。光合系统Ｉ的一个单体单元逡逑由１２７种辅因子和多种不同蛋白质（ＰｓａＡ，邋ＰｓａＢ，ＰｓａＣ，ＰｓａＤ，邋ＰｓａＥ，邋ＰｓａＦ，逡逑ＰｓａＧ，等１６个蛋白质）共价结合组成，研究表明，，大多数辅因子和蛋白质的结逡逑合位点是特异性的且保守性较强［２８］。逡逑ＰＨＯＴＯＳＹＮＴＨＥＳＩＳ逦，邋Ｈ邋ｐｈｏｔｏｓｙｘｔｌｈｅｔｕ；邋ｏｉｒｇａｎｉｓｎａ逦逦Ｑ３Ｈ＋邋ｉ邋ＡＴＰ逡逑ＮＡＤＰＨＯ邋Ｈ＋ＪＯＱＮＡＤＰ＋逦ｈ，Ｔ邋ｌ邋（７逦＼逡逑ｈ＇逦ＣＡｎｔ邋ｈｅｎｎａ邋Ｐｒｏｔｅｉｎｓ＇）逦Ｔ逦Ｉ逦／逦Ｔ邋１邋（邋＾邋）邋／逡逑／邋Ｊ邋＼逦ｃｏｎｑＤｌｅｘ邋ｄ逡逑０邋Ｏ邋Ｏ逦Ｏ逦Ｏ逡逑ＨＪ0邋Ｔ邋—逦２ｊ２Ｈ＋逦逡逑图１．１光合系统示意图逡逑Ｆｉｇｌ．ｌ邋Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ邋ｓｙｓｔｅｍ邋ｄｉａｇｒａｍ逡逑大亚基ＰｓａＡ和ＰｓａＢ是最重要的亚基，位于ＰＳ邋Ｉ单体的中心。它们含有大逡逑部分天线系统的叶绿素和类胡萝卜素以及从Ｐ７００到第一个ＦｅＳ簇ＦＸ的电子传逡逑递链的大部分辅助因子［２９］。小疏水亚基位于ＰｓａＡ和ＰｓａＢ的外围。ＰｓａＬ，邋Ｐｓａｌ逡逑和ＰｓａＭ位于单体之间的界面处

氨基酸序列,复合物,叶绿素,光系统

２．２邋ＰＳ邋ＩＩ复合物逡逑ＰＳＩＩ是一个独立的复合体，在叶绿体中含量较多的膜蛋白，能够吸收光能逡逑分解水。ＰＳＩＩ蛋白结构如图１．１所示；它是由ＬＨＣ复合体和光合系统ＩＩ蛋白二聚逡逑体组成。研究证明，ＰＳＩＩ包含至少２５个多肽（图１．２），可分为天线和核心两逡逑部分［３７］，其中包括稳定结合的蛋白和瞬时结合的蛋白。天线系统由Ｌｈｃａ和Ｌｈｃｂ逡逑两种捕捉色素蛋白复合物组成；：Ｌｈｃｂ与５０个叶绿素ａ分子结合并与反应中心紧密逡逑结合成内周天线（Ｉｎｎｅｒ邋ａｎｔｅｎｎａｓ）系统ＣＰ４３邋和ＣＰ４７（ＣＰ：邋Ｃｈｉ－Ｐｒｏｔｅｉｎ邋Ｃｏｍｐｌｅｘ），逡逑它们共同组成了邋ｐｓ邋ｎ核心复合物。与ｐｓ邋ｉｉ核心具有相互作用的是第二种天线色逡逑素－捕光色素复合物Ｌｈｃａ，它由２０－３０ＫＤａ的多肽组成，并与叶绿素ａ、叶绿素ｂ、逡逑叶黄素和胡萝卜素结合［３８－３９］。逡逑ＰＳＩＩ复合物，由又称外周天线，内周天线ＣＰ４３、ＣＰ４７和反应中心ＲＣ复合逡逑物组成，ＣＰ４３、ＣＰ４７分局ＲＣ两侧。光系统ＩＩ的内部触角ＣＰ４７和ＣＰ４３，分别逡逑由叶绿体基因ＰｓｂＢ和ＰｓｂＣ编码的产物构成。每个内周天线系统都具有六个跨逡逑膜螺旋，它们的氨基酸序列与光系统Ｉ的较大反应中心的载脂蛋白片段具有较高逡逑的同源性［４０ＬＣＰ４７参与锰与蛋白的结合。ＣＰ２９是叶绿素结合蛋白和核基因ＭｃＷ逡逑６逡逑
【学位授予单位】：浙江师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S511

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