耐丁醇大肠杆菌BW1857功能基因鉴定及耐丁醇工程菌株构建

发布时间：2020-05-29 11:53

【摘要】：随着能源匮乏和环境危机的加剧,生物丁醇作为新型清洁能源和化学品备受瞩目。合成生物学技术的发展促使非天然产丁醇的大肠杆菌(Escherichia coli)成为丁醇生物合成的重要底盘菌株,但丁醇对细胞毒性是生物丁醇产量提高的瓶颈。因此,研究丁醇耐受相关的功能基因及选育耐受高浓度丁醇的菌株对高效生物丁醇生产十分必要。本实验室前期利用易错PCR全基因组改组技术筛选到两株丁醇耐受性能良好的E.coli突变株BW1847和BW1857,本研究对两突变株在高浓度丁醇胁迫下的生长评价发现其可耐受2%(v/v)的丁醇。对BW1857菌株进行突变基因鉴定,发现其有7个突变基因和含有17个基因的14 kb基因片段缺失。对突变及缺失基因的功能互补实验结果表明dgsA和mdtJ基因双缺失导致菌株生长和丁醇耐受力下降;tqsA基因的缺失导致菌株在0-0.75%(v/v)丁醇胁迫时生长受抑制,但在1-1.5%(v/v)丁醇胁迫时促进菌株的生长;rplB基因491T突变为491A能提高BW1857突变株的丁醇耐受性。这些丁醇耐受功能基因的鉴定为丁醇耐受机制的解析及丁醇耐受菌株构建提供了理论基础。为了研究不同功能的丁醇耐受基因组合表达对菌株丁醇耐受性的影响,本研究进一步将BW1847和BW1857突变株鉴定出的丁醇耐受功能基因及已报道的丁醇耐受相关基因在大肠杆菌基因组上进行相应过表达和缺失的组合构建。利用染色体位点特异性无痕重组或CRISPR-Cas9系统介导的基因编辑技术构建出的包含有acrB缺失、rob点突变(686-687 AT缺失)的HBT1比单独缺失或点突变菌株在0.75%(v/v)丁醇胁迫时的耐受性提高22%-26%;HBT4菌株为出发菌敲除tqsA基因获得的HBT6菌,其丁醇耐受性比出发菌提高10%。组合构建的acrB、tqsA缺失,rob点突变和groESL过表达的HBT6菌株在0.75%(v/v)丁醇条件下的耐受性与BW1847和BW1857相似,在1.25%(v/v)丁醇胁迫时的最大细胞密度比野生型BW25113、BW1847和BW1857的高约80%、43%和15%。说明运用组合策略可富集E.coli耐受丁醇的有益性状。综上所述,本研究鉴定了BW1857突变株中的丁醇耐受功能基因,为解析丁醇耐受机制奠定理论基础。进一步运用组合策略研究丁醇耐受功能基因协同表达对丁醇耐受性的影响,为运用反向代谢工程构建高效抗逆菌株提供理论依据,也为合成生物学构建丁醇生产菌株提供了优良性状的底盘菌。
【图文】：

天津大学硕士学位论文果，因此需对丁醇合成途径进行优化以获得高丁醇产量。1.4.2 丁醇合成途径酶的优化异源表达的梭菌丁醇代谢途径中，大多数酶促反应是可逆的，催化效果未能达到最优水平，在引入 E. coli 后需对酶促反应的催化剂进行优化，其中乙酰-CoA 在硫解酶的作用下生成乙酰乙酰-CoA。Atsumi 等在表达梭菌硫解酶（thl 编码）的同时，过表达了 E. coli 同样能催化该反应的乙酰转移酶（atoB 编码），，丁醇产量为对照菌株的 3 倍，这可能是由于 atoB 天然酶的活性更高[50]。天然代谢途径利用 NADH 和还原铁氧还蛋白（Bcd-EtfABcomplex）作为还原力的来源，若能改造丁醇途径使 NADH 作为唯一的还原力来源，则可通过敲除混合酸

第 1 章 文献综述DNA 结合后，包含 HNH 和 RuvC 两个内切酶结构域的 Cas9 蛋白会在 PAM位点上游三个碱基处切割双链 DNA 分子[64]。Jinek 等人设计出一个模拟tracrRNA-crRNA 复合物的小的向导 RNA（sgRNA; single-guide RNA），可通过改变与目标 DNA 序列结合的导向嵌合 RNA 序列使 sgRNA 靶向作用于任何感兴趣的双链 DNA 序列（图 1-2）[65]，通过非同源重组连接或同源重组修复该缺口。在同源重组过程中，供体 DNA 的加入可在突变位点加入新的序列信息[63]。
【学位授予单位】：天津大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q78

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1 贺雪婷;耐丁醇大肠杆菌BW1857功能基因鉴定及耐丁醇工程菌株构建[D];天津大学;2018年

本文编号：2686888