烟草维管束发育相关基因sm-Nvas启动子顺式作用元件的鉴定

发布时间：2020-05-29 14:02

【摘要】：启动子是基因工程中的一把关键的钥匙,它能够决定外源基因的转录方式,选择合适的启动子调控不同外源基因的表达在生物学研究中具有重要作用。组织特异性启动子能驱动外源基因在特定的部位高效表达,同时还能避免组成型启动子带来的营养浪费等缺陷。发掘合适高效的组织特异型启动子及其顺式作用元件的解析是启动子研究工作中的重点。前期本实验室从W38型烟草中克隆得到了sm-Nvas启动子区域的序列,生物信息学分析及转基因实验证实该启动子与维管束发育相关。本研究旨在分析sm-Nvas启动子的驱动活性,鉴定sm-Nvas启动子的顺式作用元件,发掘新的组织特异型高效启动子。本研究取得的结果主要有:(1)对sm-Nvas启动子进行5’端缺失分析,以起始密码ATG中的A为+1位点,将sm-Nvas启动子-799区域分为20个长度不同的5’端缺失片段,并替换p CAMBIA1301、p CAMBIA1302的35S启动子与报告基因融合,共构建20个5’端缺失片段-GUS重组载体和20个5’端缺失片段-GFP重组载体。通过农杆菌介导法分别将这40个重组载体遗传转化至W38型烟草中,得到阳性转基因烟草植株。(2)完成GUS组织化学染色及GFP荧光观察,结果进一步证实sm-Nvas启动子属于组织特异型启动子。所有得到的转基因植株均能检测到报告基因的表达,sm-Nvas启动子-216区域足以驱动外源基因在维管束组织中表达,-216区域内存在启动子核心元件和维管束组织特异表达元件。(3)报告基因表达量结果显示sm-Nvas启动子驱动活性远高于35S启动子,是一个维管束组织特异型强启动子。-402～-640区域表达量显著增高,且-640区域驱动活性最高,表明-402～-337区域存在一个能上调启动子活性的元件。-680～-640区域存在一个能下调启动子活性的元件,与上调启动子活性的元件相互拮抗。
【图文】：

示意图,启动子结构,示意图,启动子

以及调控方面起着关键作用（Niu et al., 2018）。1.1.1 真核启动子结构真核生物存在 PolⅠ、PolⅡ、PolⅢ 三种 RNA 聚合酶，相应的也有Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型三种启动子分别与其结合并活化，从而起始基因的转录。Ⅰ型启动子主要驱动 rRNA 的转录，，Ⅱ型启动子驱动 mRNA 和部分核小 RNA 的转录，Ⅲ型启动子负责 tRNA 的转录。Ⅱ型启动子结构最为复杂，本研究中的启动子属于Ⅱ型启动子。Ⅱ型启动子结构包括转录起点（initiator, Inr）、TATAbox、CAAT box和上游顺式调控元件（upstream control element, UCE）如图 1.1。TATAbox 是 PolⅡRNA 聚合酶与启动子结合的核心元件，介导前转录复合物的形成，控制 PolⅡRNA 聚合酶结合的位置以及转录起始的准确性，还能控制某些启动子的转录方向（李明和陆长德，1995）。上游顺式调控元件可以和反式作用因子结合从而调控转录效率。

分析图,缺失法,分析图,启动子

缺失后与报告基因融合，转化到受体植株中通过检测报告基因的表达来分析不同长度的启动子片段。单侧缺失包括 5’端缺失分析和 3’端缺失分析，是从启动子的一侧利用 PCR 手段得到一系列截短的片段。内部缺失则是缺失掉启动子内部某一区域。这种片段缺失分析方法将启动子划分成几个区域，再通过比较几个启动子片段驱动报告基因的情况，从而鉴定启动子的顺式作用元件所在的区域。利用 5’端缺失分析方法，水稻 OsOPR1 启动子上一个 19bp 区域的茉莉酸响应元件被发现（如图 1.2）（Sobajima et al., 2007）。对烟草 NtMTPC4 启动子进行缺失分析，构建三个缺失载体和一个全长载体，利用花序侵染法转化拟南芥，结果发现均能驱动外源基因在花粉中表达（刘继恺等，2017）。对苹果品种‘嘎拉’中β—半乳糖苷酶基因 Md-gal 启动子区域通过缺失分析，发现该启动子存在正调控区和负调控区，并且能响应激素诱导，推测启动子可能和苹果的生长发育以及成熟软化有关（蒋小兵等，2017）。柳枝稷 PvPfn2 启动子截短部分 413bp 被证实足以高效驱动外源基因在维管束中表达（Xu et al., 2018）。
【学位授予单位】：中南民族大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q943.2

【参考文献】