嗜热真菌糖苷水解酶第七家族基因的克

发布时间：2020-05-29 22:17

【摘要】：纤维素作为一种含糖量最为丰富的可再生能源,在解决能源短缺方面具有重要的意义。研究发现纤维素酶降解纤维素是一种既环保又高效的方法。在纤维素降解过程中,酶活力高、热稳定性强的纤维素酶是提高酶解效率、减少成本的关键。嗜热真菌产生的纤维素酶具有较高的酶活性及热稳定性。本研究分别将嗜热毁丝菌糖苷水解酶第七家族外切葡聚糖酶cbh1基因和嗜热毛壳菌糖苷水解酶第七家族内切葡聚糖酶eg2基因进行克隆、表达,获得外切葡聚糖酶CBH1和内切葡聚糖酶EG2。将纯化的蛋白CBH1和EG2进行SDS-PAGE电泳检测,CBH1的理论大小为54 kDa,而电泳结果显示蛋白的大小为72 kDa,推测蛋白可能存在糖基化修饰;EG2的电泳结果显示蛋白的大小为45 kDa,与理论值大小(45 kDa)相符。为了获得具有更高活性的纤维素酶,提高纤维素酶对纤维素的降解效率,本研究分别对CBH1和EG2进行分子改造,期望可以获得具有更高酶活性及热稳定性的纤维素酶。根据同源建模的方法,分别对外切葡聚糖酶CBH1和内切葡聚糖酶EG2进行三维结构的预测。糖苷水解酶第七家族(GH7)外切葡聚糖酶(CBHs)在催化中心活性通道的顶端有一个环状结构,嗜热毁丝菌糖苷水解酶第七家族外切葡聚糖酶CBH1的环状结构由9个氨基酸组成,即G245-Y253,将该结构进行敲除,获得缺失突变体CBH1-DM;根据三维结构,选取CBH1底物结合平面内四个保守的芳香族氨基酸W38、W40、W372和W381以及EG2活性通道内,位于活性位点6?范围内的五个非保守氨基酸A141、L145、M195、I207和M342进行定点突变,获得CBH1的八个突变酶W38Y、W38F、W40Y、W40F、W372Y、W372F、W381Y和W381F以及EG2的四个突变酶A141S、L145T、M195L、I207V和M342F。将原酶和突变酶进行酶学性质的测定。实验结果表明,本研究已经成功获得两个酶活力提高的突变体,分别为CBH1-DM和W38Y。CBH1-DM的比活力为2.42 U/mg,是野生酶CBH1(1.17 U/mg)的2.1倍,突变酶W38Y的比活力为1.3 U/mg,是CBH1(1.17U/mg)的1.1倍,剩余突变酶的酶活均有不同程度的降低;CBH1、CBH1-DM的最适温度均为50℃,剩余突变酶的最适温度为60℃;CBH1及突变酶的最适pH均为5.0;在70℃处理1小时后,CBH1仅剩余35%的酶活力,而CBH1-DM剩余65%的酶活力,CBH1-DM的热稳定性显著提高,而其他突变酶的热稳定性均有不同程度的降低。突变酶与野生酶EG2相比,酶活性均有不同程度的降低;EG2与突变酶最适温度均为50℃,最适pH均为5.0;与EG2相比,在80℃处理1小时后,EG2具有50%的酶活,而M195L具有65%的酶活,M195L的热稳定性提高,而其他突变酶的热稳定性均有不同程度的降低。
【图文】：

外切葡聚糖酶,里氏木霉,山东农业大学,硕士学位论文

山东农业大学硕士学位论文和一个球形的头部，如图 1-1 所示（Esterbauer et al., 1991）。经过不断研酶的分子结构均类似于蝌蚪状，整个纤维素酶分子由三部分组成，分别是cellulose-binding domains CBD）、催化结构域（catalytic domains CD）和er）（Srisodsuk et al., 1993; 阎伯旭和高培基, 1995）。

模式图,假说,协同作用,模式图

图 1-3 协同作用假说模式图Fig.1-3 Model of Synergetic hypothesis酶的应用产生的纤维素酶具有较高的活性及产量，因此在环境治理和食用：在榨取蔬菜汁、水果汁的过程中加入纤维素酶可以提高汁液的汁液，而且获得的汁液不易产生沉淀（Beguin andAubert, 19纤维素酶可以加强对原料的利用效率，提升酒的品质（高蕾蕾等；利用纤维素酶可以制备一些酶制剂，各种酶制剂的生产对危机具有重要的作用（Zhang et al., 2006; Angenent et al., 2004油开采过程中使用破乳剂可以减少对地面的破坏（王玉芝, 19展以及人们生活质量的提高，，对生活垃圾的处理越来越受到人要成分有纤维素和木质素，瘤胃真菌产生的纤维素酶能将纤维理生活垃圾方面起到很好的作用（Mountfort et al., 1982）。此
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q936;Q78

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