茭白PIN1基因克隆及其在茎部膨大发育中的调节分析

发布时间：2020-05-30 07:18

【摘要】：茭白孕茭是由菰黑粉菌侵染植株后诱导茎部器官形态发育变化的结果,膨大后植株茎部顶端生长优势受到显著抑制。PIN1是IAA极性运输的输出载体,在植物生长发育中具有重要调节作用,参与了植物胚胎发育、维管组织发育、细胞大小、向性运动、花器官发育等重要调控。本研究克隆获得双季茭白“浙茭7号”IAA极性运输相关基因Zl-PIN1、Zl-PIN1b及Zl-PIN1c基因的全长序列,明确其在茭白茎部膨大发育中的表达模式,阐明了IAA及TIBA对茎部PIN1相关基因的诱导表达模式,结合茎部菰黑粉菌菌丝生长分布动态,探讨了Zl-PIN1、Zl-PIN1b及Zl-PIN1c基因表达与茭白茎部发育及孕茭表型的关系;基于菰黑粉菌体外培养及田间孕茭生产的比较分析,明确了IAA及TIBA对菰黑粉菌菌丝体外融合生长及茭白田间生产的调节作用,探讨了基于IAA极性运输调节促进茭白孕茭的可能机制。此外,构建了茭白Zl-PIN1过表达遗传转化体系,为后续茭白基因功能验证分析提供了技术支撑。主要结果如下:一、茭白Zl-PIN1、Zl-PIN1b及Zl-PIN1c基因全长克隆克隆获得茭白Zl-PIN1、Zl-PIN1b及Zl-PIN1c基因全长序列,均具有植物生长素输出载体蛋白PIN1特有的Mem_trans结构域。Zl-PIN1基因组全长为2408 bp,cDNA全长为1 770 bp,编码589个氨基酸,含有6个外显子和5个内含子,与粳稻关系较近,氨基酸序列相似性为96%;Zl-PIN1b基因组全长为2024bp,cDNA全长为1 563 bp,编码526个氨基酸,含有4个外显子和3个内含子,与野生稻关系较近,氨基酸序列相似性为87%;Zl-PIN1c基因组全长为2421 bp,cDNA全长为1 797 bp,编码598个氨基酸,含有6个外显子和5个内含子,与野生稻关系较近,氨基酸序列相似性为95%。进化树分析表明:Zl-PIN1与Zl-PIN1c可聚为一类,与Zl-PIN1b距离较远,可能与预测的蛋白跨膜螺旋区结构不同相关。二、Zl-PIN1、Zl-PIN1b及Zl-PIN1c基因在茭白茎部发育中的表达模式分析3种孕茭表型间的表达模式分析发现,Zl-PIN1、Zl-PIN1b及Zl-PIN1c基因与茭白茎部器官的形态转变相关:膨大初期的正常茭白与灰茭茎部中3个基因表达量均显著低于雄茭(P0.05);雄茭茎部发育前中期(5叶期与8叶期)3个基因的表达变化没有显著差异,但在茎部伸长发育后(正常茭白膨大初期)表达显著升高(P0.05),表明Zl-PIN1、Zl-PIN1b及Zl-PIN1c可能参与了茭白茎部拔节发育相关的顶端生长调节。膨大茎部Zl-PIN1与Zl-PIN1c表达模式基本一致,并与Zl-PIN1b表达模式差异显著:正常茭白茎部膨大发育期间Zl-PIN1与Zl-PIN1c表达量逐渐升高,并在茎部膨大发育到10 cm时表达量最高,随后表达量显著下降(P0.05);而Zl-PIN1b基因在茎部发育中表达量逐渐降低,膨大发育10 cm时显著升高,随后显著下降(P0.05),可能与膨大茎部的伸长相关。灰茭茎部3个基因表达模式与正常茭白存在差异:茎部发育期间Zl-PIN1与Zl-PIN1c表达量逐渐升高,膨大后期表达量显著高于正常茭白(P0.05);而Zl-PIN1b基因逐渐降低,膨大10 cm时灰茭茎部基本不表达,可能与正常茭白与灰茭茎部菰黑粉菌侵染及生长分布状态的显著差异相关。茭白茎部Zl-PIN1、Zl-PIN1b及Zl-PIN1c基因表达受IAA及TIBA诱导调节,剂量效应显著:IAA处理可以显著诱导雄茭茎部Zl-PIN1及Zl-PIN1b基因上调表达(P0.05),但对Zl-PIN1c基因的诱导表达不显著;IAA处理后正常茭白茎部3个基因表达均显著下调(P0.05);此外,高浓度TIBA处理后正常茭白茎部中3个基因表达均显著下调(P0.05),但低剂量抑制效果不显著。正常茭白茎部Zl-PIN1、Zl-PIN1b及Zl-PIN1c基因的诱导表达可能与其茎部菰黑粉菌菌丝生长调节相关。茎部组织切片观察发现:正常茭白植株发育期间,茎部菰黑粉菌菌丝生长及分布逐渐增强;高浓度TIBA处理后,8叶期茭白茎部中大量增殖分布的菰黑粉菌菌丝生长受到抑制。三、生长激素对菰黑粉菌体外培养及菌丝生长的影响菰黑粉菌菌株的体外融合菌丝生长分析发现:IAA能够促进菰黑粉菌菌丝生长,T型和MT型菌株间的促进效果基本一致,与IAA处理浓度成正相关;低浓度TIBA可以促进菰黑粉菌菌丝生长,而高浓度TIBA能够抑制菰黑粉菌菌丝生长,菰黑粉菌单倍体菌株培养干重量的显著降低(P0.05)。T与MT型菌株间对TIBA处理的耐受能力存在差异:10μM的TIBA处理后,T型与MT型菌株干重均未受到显著影响,但T型菌株菌丝生长受到抑制,而MT型菌株菌丝生长促进效果较好,MT型菌丝生长对TIBA的耐受力较强;50μM的TIBA处理后,T型与MT型菰黑粉菌均无法形成融合菌丝,MT型菌株干重显著减少(P0.05),而T型菌株干重变化不显著,T型菌株单倍体生长对TIBA的耐受力较强。此外,6-BA能促进T型菰黑粉菌菌丝生长,并与浓度呈正相关,与IAA处理结果类似;低浓度6-BA(1-5μM)处理能够促进MT型菰黑粉菌融合菌丝生长,而高浓度6-BA可以抑制融合菌丝的生长,与TIBA处理结果类似。四、生长激素对茭白田间孕茭生产的调节分析生长激素处理能够有效调节茭白田间孕茭生产的采收周期及产量。孕茭起始时外源IAA喷施能够延迟茭白采收,采收盛期延迟约9-12天,但对茭白产量影响不明显;TIBA能够促使茭白采收盛期提前,产量增加集中在采收前期;而6-BA处理可以增加茭白采收中期的产量。茭白经济学性状调查发现:IAA处理能够减少茭白有效分蘖数,而TIBA和6-BA处理能够显著提高茭白的有效分蘖数(P0.05),田间增产效果明显;外源激素处理对壳茭重、净茭重及茭肉长和粗等性状影响不显著。田间植物学性状分析表明:IAA有助于促进茭白株高、叶长和叶宽的生长,而TIBA和6-BA对茭白株高增长具有一定抑制作用,但与对照相比差异不显著。结合生长激素对菰黑粉菌体外培养的影响分析,TIBA可能通过影响茎部菰黑粉菌菌丝生长及IAA极性运输,调节茭白茎部膨大起始后的生长发育,促进茭白植株营养物质在植株顶端生长及茎部膨大发育中的有效分配。五、Zl-PIN1过表达遗传转化体系的构建构建了Zl-PIN1的过表达遗传转化载体pFGC-Egfp-Zl-PIN1,采用农杆菌介导的苗端生长点转化法转化野茭植株,PCR筛选鉴定获得10株转基因阳性植株,基于GFP荧光信号显微镜观察发现,Zl-PIN1蛋白定位在维管束周围细胞的细胞膜底部,与已报道的OsPIN1定位一致,初步确定获得茭白Zl-PIN1过表达转基因植株,转化率约为3.7%。
【图文】：

Zl-PIN1b 及 Zl-PIN1c 基因全长序列克隆1 基因全长序列克隆因组及转录组数据分析[19]，以茭白 cDNA 和基引物进行 PCR 扩增，电泳结果如图 2.1 所示，白 Zl-PIN1 基因的 DNA 全长序列为 2 408 bp；码 589 个氨基酸。采用 Clone Manager 软件т析发现：茭白 Zl-PIN1 基因含有 6 个外显子和子大小分别为 1 117 bp、271 bp、88 bp、156 bp为 87 bp（第 1118 个碱基到第 1204 个碱基）、5 个碱基）、89 bp（第 1674 个碱基到 1762 个基到 2158 个碱基）、103 bp（第 2239 个碱基到

中国计量大学硕士学位论文图 2.2 Zl-PIN1 基因组和 cDNA 比对图2.2.1.2 Zl-PIN1b 基因全长序列克隆以茭白 cDNA 和 DNA 为模板，设计特异性引物进行 PCR 扩增，电泳结果如图 2.3 所示，PCR 扩增产物测序分析发现：茭白 Zl-PIN1b 基因的 DNA 序列全长为 2 024 bp；cDNA 序列全长为 1 563 bp，，编码 526 个氨基酸。采用 CloneManager 软件т的 Align multiple sequences 比较分析发现：茭白 Zl-PIN1b 基因包含 4 个外显子和 3 个内含子（图 2.4），4 个外显子大小分别为 1 036 bp、248bp、86 bp、211 bp，3 个内含子分别为 259 bp（第 1037 个碱基到第 1295 个碱基）、104 bp（第 1544 个碱基到第 1647 个碱基）、80 bp（第 1734 个碱基到1813 个碱基）。
【学位授予单位】：中国计量大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S645.2

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 刘小丽;高惠英;;Pin1及其在自身免疫性疾病中的研究进展[J];中国临床研究;2019年11期

2 白志刚;韩威;马雪梅;张忠涛;叶颖江;;PIN1在胃癌组织中的表达及其预后意义[J];临床肿瘤学杂志;2012年05期

3 张雅琴;白光辉;郭云娣;;PIN1蛋白在胃癌组织中表达及其临床意义[J];江苏医药;2015年18期

4 许晓梅;胡怀东;廖勇;张大志;;应用组织芯片检测Pin1在肝炎、肝硬化、肝细胞性肝癌组织中的表达[J];重庆医科大学学报;2010年09期

5 焦娟;徐丽秀;肖金宝;郭春凤;马俊旗;阿仙姑·哈斯木;;Pin1蛋白与上皮间质转化相关蛋白在宫颈鳞癌中的表达及意义[J];新疆医科大学学报;2017年10期

6 曹文平;阮宏莹;唐慧玲;林鹏;;Pin1基因多态性与喉鳞状细胞癌的相关性[J];江苏医药;2012年09期

7 吴限;陈素琴;李莎;郭芙蓉;黎明江;;Pin1在盐酸异丙肾上腺素诱导的心肌纤维化大鼠中的表达[J];广西医学;2017年04期

8 刘群;赖长城;毛宇彬;洪亮;孙丽芳;宋崴;吴学记;;pin1基因在非小细胞肺癌中的表达及其意义[J];中国癌症杂志;2008年08期

9 熊文化;陈安民;郭风劲;张衣北;黄涛;;正反义人PIN1基因克隆及真核表达载体的构建[J];华中医学杂志;2006年03期

10 刘涛;胡海涛;;Pin1在阿尔茨海默病中的作用机制[J];医学综述;2010年03期

相关会议论文 前10条

1 朱园园;黄河;孙洁;蓝建平;来晓瑜;李静远;施继敏;余建;谭亚敏;林茂芳;;Pin1在恶性血液病细胞中的表达及与细胞周期关系的研究[A];浙江省免疫学会第五次学术研讨会论文汇编[C];2004年

2 朱文凯;刘买利;杨运煌;;结构域间的接触程度调控Pin1酶活的正协同效应研究[A];2018第二十届全国波谱学学术年会会议论文摘要集[C];2018年

3 谭兰;欧江荣;王翔祥;;Pin1基因启动子-842G/C位点多态性与散发性阿尔茨海默病的关联分析[A];第十一届全国神经病学学术会议论文汇编[C];2008年

4 李雨晴;罗周嵩;郑春燕;张峰顺;吴思英;李煌元;卢坤平;;脯氨酰顺反异构酶Pin1在氯化钴致大脑神经细胞退行性损害中的作用及机制[A];2018环境与健康学术会议--精准环境健康：跨学科合作的挑战论文汇编[C];2018年

5 李雨晴;罗周嵩;郑春燕;吴思英;李煌元;卢坤平;;脯氨酰顺反异构酶Pin1在氯化钴致大脑神经细胞退行性损害中的作用及机制[A];中国毒理学会第七次全国会员代表大会暨中国毒理学会第六次中青年学者科技论坛论文摘要[C];2018年

6 朱园园;黄河;孙洁;蓝建平;来晓瑜;李静远;施继敏;余建;谭亚敏;林茂芳;;Pin1在恶性血液病细胞中的表达及与细胞周期关系的研究[A];中华医学会第八次全国血液学学术会议论文汇编[C];2004年

7 曹启军;陈元;;Pin1：肿瘤形成的催化分子和治疗靶点[A];第二届湖北省肿瘤靶向治疗学术会议论文选[C];2007年

8 熊文化;庞清江;杨长春;袁欣华;陈晓牛;;PIN1反义基因转染抑制人骨肉瘤细胞的增殖[A];2006年浙江省骨科学术会议暨浙江省脊柱脊髓学术会议论文汇编[C];2006年

9 李巍;刘剑利;李晓瑜;李子政;李海洲;李福才;;喉癌中PIN1基因的表达及扩增研究[A];遗传学进步与人口健康高峰论坛论文集[C];2007年

10 谭师师;沈爱国;郭荆哲;谢微;胡继明;;表面增强拉曼光谱成像研究拟南芥根尖PIN1二维分布[A];第十四届全国光散射学术会议论文摘要集[C];2007年

相关博士学位论文 前6条

1 金晶;Pin1在人恶性黑色素瘤发生发展中作用研究 Pin1抑制剂的筛选及机制研究 XLN306的抗肿瘤作用及机制研究[D];北京协和医学院;2010年

2 钱颖;应用RNAi技术抑制Pin1基因表达对宫颈癌生物学行为的影响及其机制研究[D];华中科技大学;2008年

3 李玲;顺反异构酶Pin1调控食管鳞癌发病的分子机制[D];郑州大学;2010年

4 林丽明;维生素D通过抑制Pin1介导的线粒体氧化应激和炎症改善糖尿病血管内皮功能障碍[D];福建医科大学;2017年

5 袁婷婷;葡萄糖通过ABA INSENSITIVE 5调控生长素抑制拟南芥主根生长[D];武汉大学;2014年

6 王热华;白藜芦醇对糖尿病ApoE~(-/-)小鼠动脉粥样硬化的影响及机制研究[D];南方医科大学;2017年

相关硕士学位论文 前10条

1 周美琪;茭白PIN1基因克隆及其在茎部膨大发育中的调节分析[D];中国计量大学;2018年

2 张楠;异构酶Pin1对瑞戈非尼耐药前后肝癌细胞侵袭转移的影响及机制研究[D];福建医科大学;2018年

3 温行;miR-200c调控PIN1对喉癌Hep-2细胞生物学行为的影响[D];中国医科大学;2018年

4 马明坤;Pin1在实验性自身免疫性脑脊髓炎中的作用及机制研究[D];天津医科大学;2018年

5 李巍;喉鳞状细胞癌中PIN1扩增及表达研究[D];中国医科大学;2008年

6 延兴学;MicroRNA-140-5p靶向Pin1阻断多条信号通路抑制肝细胞癌[D];福建医科大学;2017年

7 何逸飞;地塞米松对肽基脯氨酰异构酶Pin1表达的调节作用[D];第二军医大学;2013年

8 周路;Pin1在骨肉瘤细胞中的表达及对细胞周期的影响[D];泰山医学院;2011年

9 顾兴洲;Pin1与CyclinD1在肾透明细胞癌中的表达及意义[D];天津医科大学;2014年

10 范国亮;成人喉乳头状瘤Pin1和CyclinD1的表达及意义[D];中国医科大学;2008年

本文编号：2687785