PPPDE1基因在肛门直肠畸形大鼠胚胎发育中的时空性表达

发布时间：2020-05-30 17:21

【摘要】：目的:检测PPPDE1基因在正常胎鼠及肛门直肠畸形(anorectal malformations,ARMs)胎鼠在肛门直肠发育过程中的表达模式,分析该基因在大鼠肛门直肠畸形发育中可能的调控作用。方法:健康Wistar大鼠,雌性和雄性大鼠午夜合笼,清晨涂片,确认怀孕的大鼠分笼放置。将已妊娠的大鼠分为2组,分别为正常组和乙烯硫脲(Ethylenethiourea,ETU)畸形组。畸形组36只孕鼠于妊娠第10天(Embryonic day10,E10)致畸处理,按125 mg/Kg给予大鼠1%ETU(浓度为1%,以生理盐水做溶剂)进行灌胃,正常组30只孕鼠给予相同剂量12.5 ml/kg的生理盐水进行灌胃。在胎鼠发育第13(E13)天至16(E16)天时剖宫取出胚胎。将取出的约1/3胚胎进行4%多聚甲醛固定,固定12-24小时,进行常规脱水处理,行石蜡包埋,行3.5μm正中矢状面连续切片,后应用免疫组织化学方法进行PPPDE1抗体染色。将约2/3胎鼠在低温条件下行显微下取材,取出胎鼠泄殖腔直肠组织置于EP管中,并于-80℃冰箱冷冻保存,分别进行Western Blot及qRT-PCR定量实验。统计分析:数据均以均值±标准差表示,差异比较采用IBM SPSS Statistics21统计软件进行配对t检验,以P值表示统计差异,p0.05认为差异有统计学意义。结果:1、免疫组织化学染色结果,在正常组胎鼠中,E13,PPPDE1阳性细胞稀疏分散在尿直肠膈和后肠上皮;E14,在尿直肠膈、后肠和泄殖腔膜上检测到PPPDE1细胞;E15,尿直肠膈的融合部分以及稀薄的肛膜处可见PPPDE1阳性细胞表达;E16,PPPDE1阳性细胞分布在肛门周围上皮。在ETU畸形组胎鼠中,E13,PPPDE1阳性细胞于尿直肠膈和后肠上皮广泛表达;E14,PPPDE1阳性细胞在尿直肠膈及后肠表达明显增加;E15,PPPDE1阳性细胞分布于瘘管和后肠上皮;E16,瘘管和直肠上皮有PPPDE1阳性细胞表达。2、Western blot实验结果,PPPDE1蛋白表达在后肠发育中随时间变化而发生变化,在E13-E14畸形组PPPDE1蛋白表达水平要显著高于同等水平正常组(E13,0.54±0.03(正常组)vs.0.67±0.08(畸形组);E14,0.48±0.003(正常组)vs.0.65±0.11(畸形组);p0.05),差异具有统计学意义。3、qRT-PCR实验结果,PPPDE1在正常组胎鼠和ARMs组胎鼠mRNA表达水平存在差异,从E13-E16,在胎鼠肛门直肠处表达逐渐增强。与正常组胎鼠相比较,ARMs组胎鼠在E13天表达明显高于正常组(E13,1.00±0.04(正常组)vs.1.24±0.13(畸形组);p0.05)差异具有统计学意义。结论:1、ETU致畸的肛门直肠畸形胎鼠在肛门直肠发育过程中PPPDE1基因的表达存在着时间-空间的不均衡性特点。2、ETU致畸的大鼠胚胎期直肠发育过程中PPPDE1基因表达模式的改变可能会引起肛门直肠畸形的发生,影响泄殖腔细胞凋亡。3、PPPDE1表达上调可能与肛门直肠畸形的发生有关。
【图文】：

直肠,尿道,泄殖腔,后肠

中国医科大学硕士学位论文3.2 免疫组织化学染色结果E13 天，正常组：尿直肠膈开始下降把泄殖腔分为尿生殖窦和原始直肠两部分，泄殖腔形态管呈三角形。在尿直肠膈 URS 和后肠上皮中检测到少量的PPPDE1 阳性细胞(图 3.1 A，B)。ARMs 组：尿直肠膈 URS 和泄殖腔膜之间的距离间隔比较远。在尿直肠膈 URS 和后肠上皮组织中可以观察到大量的 PPPDE1阳性细胞 (图 3.1 C，，D)。

直肠,直肠尿道瘘,泄殖腔,窦道

中国医科大学硕士学位论文E14 天，正常组：尿直肠膈突出，其尖端接近泄殖腔膜，几乎融合，可以看到尿直肠膈 URS 和泄殖腔膜 CM 有一条窦道。PPPDE1 阳性细胞散在分散在尿直肠膈和泄殖腔膜上（图 3.2 A，B）。ARMs 组：尿直肠膈 URS 在泄殖腔里的位置较高，尿直肠膈和泄殖腔膜之间的间距较长，随后发育过程中尿直肠膈没有与泄殖腔膜进行融合，而出现直肠尿道瘘。PPPDE1 细胞在尿直肠膈和泄殖腔膜表达较正常组明显（图 3.2 C，D）。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R725.7

【参考文献】