桑树G蛋白信号基因的鉴定与非生物胁迫调控分子机理研究

发布时间：2020-05-31 00:17

【摘要】：干旱、高温、冷害、营养匮乏、盐害以及重金属毒害等非生物胁迫严重影响了植物的生长、发育和繁衍继代。植物为了在逆境胁迫下求得生存,通过改变自身的生理生化过程来适应胁迫环境,进化了一套感知和传递胁迫信号、转录调控和胁迫响应的生理途径,使植物做出适应性反应。其中感知和传递胁迫信号对于植物适应胁迫环境起着关键的作用,胁迫信号感受器、受体激酶、第二信使、Ca~(2+)信号途径、脱落酸(ABA)信号途径、盐过敏感(Salt overly sensitive,SOS)信号途径、促分裂素原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)级联途径、活性氧(Reactive oxygen species,ROS)信号途径和转录因子等都在这个过程中扮演了重要的角色。异三聚体G蛋白(G蛋白)是一种第二信使,其参与的信号转导途径是真核生物中一种非常保守的跨膜信号转导机制,调控了信号感知、信号转导、激素响应和免疫反应等信号途径。在植物中,G蛋白调控了植物的形态发育、气孔关闭、光信号响应、糖信号响应、生物与非生物胁迫响应等生理过程。到目前为止,虽然植物G蛋白信号响应非生物胁迫分子机制在拟南芥和水稻等模式植物中的研究报道较多,但其在木本植物中的研究报道很少,且其信号途径中仍有一些研究不清楚和存在争议的关键途径和调控模式有待阐明。桑树是一种多年生木本经济植物,其叶片是饲养家蚕最理想的饲料。此外,桑树在生态、食用和药用中也有广泛的应用。桑树在干旱、盐胁迫、水涝和重金属胁迫等逆境胁迫环境下都有良好的适应能力,被认为是一种很有前景的治理生态脆弱环境的生态经济树种,但对其分子机理的研究还比较少。桑树G蛋白信号基因的相关研究也未见报道且通过对桑树盐胁迫转录组数据进行权重基因共表达网络分析(WGCNA)发现其与大量其他胁迫响应基因的连通性较高。因此,开展桑树G蛋白信号基因的功能研究,不但对于探究桑树响应非生物胁迫机制具有重要的意义,而且也将有助于植物G蛋白信号途径的不断完善,特别是仍有待阐明和存在争议的一些关键途径。本研究选取新疆和田地区的桑树品系策沙6号和策沙12号作为研究材料,对其进行了盐胁迫处理,转录组测序分析了桑树响应盐胁迫的重要基因和桑树G蛋白信号基因与其他胁迫响应基因的连通性。利用生物信息学方法、基因克隆和酵母双杂交(Y2H)技术鉴定了桑树G蛋白信号基因,采用实时定量PCR技术检测其在不同组织中以及在G蛋白效应物、非生物胁迫和信号分子的处理下的表达情况。在烟草或拟南芥中过表达桑树G蛋白信号基因,分析了过表达植物对干旱和盐胁迫抵抗能力的变化。此外,还利用Y2H、酵母三杂交(Y3H)和双分子荧光互补(BiFC)等技术筛选分析与G蛋白信号蛋白相互作用的蛋白。论文获得的主要研究结果如下:1、桑树盐胁迫转录组学分析对策沙6号和策沙12号进行盐胁迫处理后,利用RNA-seq技术进行转录组学分析。一共从24个处理样本中获得了101589个基因,其中34.72%的基因能够在NCBI、KEGG、SwissProt和Pfam等公共数据库中获得注释。对响应盐胁迫的差异基因进行分析,发现参与离子转运、ROS清除、ABA生物合成、Ca~(2+)信号途径和MAPK途径的基因都不同程度地响应盐胁迫,编码受体激酶、转录因子、热激蛋白、水通道蛋白、胚胎发育晚期丰富蛋白、渗透蛋白和△1-吡咯啉-5-羧酸合成酶的基因也响应了盐胁迫。分析结果也表明在桑树种子萌发阶段进行盐处理,萌发快的种子长成的植株表现出更强的抗盐性,通过在种子萌发阶段进行盐胁迫处理可以筛选出抗性较强的株系,其原因可能是在种子萌发期进行胁迫后提高了植物面对再次胁迫的抵抗能力,即前处理赋予了植株的胁迫记忆。分析发现低抗品系中的差异基因显著多于高低抗品系,暗示低抗品系比高抗品系对盐胁迫的响应更加敏感。对不处理情况下高低抗品系之间的差异基因进行分析发现,在根中的差异基因数量显著高于茎和叶中的差异基因,表明高抗和低抗品系间的差异主要在根中体现。对转录组数据进行WGCNA分析发现,cyan、darkgrey和violet等重要模块的基因主要富集在剪接体、RNA转运、真核生物核糖体的生物发生、泛素介导的蛋白水解、基本转录因子、mRNA监控通路、内质网蛋白加工和内吞途径等途径中。以上结果暗示在种子萌发期间进行盐胁迫处理,可能改变了植物的抗逆性,并赋予了植物在RNA和蛋白质水平的胁迫记忆,提高了植物面对再次发生的盐胁迫的抵抗能力。对G蛋白信号基因的表达模式进行分析发现,Gα和Gγ2位于brown模块,Gβ和RGS位于black模块,Gγ1和RACK1位于green模块,与G蛋白信号基因连通性较高的基因包括了编码RLKs、WRKY、E3连接酶、CDPK、细胞色素P450、PPR、ERF和钙调蛋白等不同类型蛋白的基因,这些基因参与了植物对胁迫的响应。在RACK1共表达基因中,有41个编码核糖体蛋白的基因,暗示RACK1可能通过调控核糖体的活性来行驶功能。推测G蛋白信号可能是调控桑树胁迫响应的重要途径之一。2、桑树G蛋白信号响应非生物胁迫的分子机理研究通过生物信息学方法和基因克隆技术从桑树中获得了6个G蛋白信号基因,包括1个Gα、1个Gβ、2个Gγ、1个RGS和1个RACK1。基因结构分析发现桑树G蛋白信号基因与拟南芥、芜菁和大豆中对应基因的结构相似,桑树Gα、Gβ、Gγ1、Gγ2、RGS和RACK1的蛋白质序列与陆地植物中对应蛋白序列的相似度很高,最高可达90%。Y2H实验证实MaGα可与MaGβ和MaRGS发生相互作用,MaGβ可与MaGγ1和MaGγ2发生相互作用。对桑树G蛋白信号基因的表达模式进行了分析,结果显示G蛋白信号基因在各个组织中表达,并表现出不同的表达模式,其表达还显著响应不同的非生物胁迫和信号分子的处理。此外,本研究也首次使用G蛋白效应物处理植物来探究其对G蛋白信号基因表达的影响,G蛋白信号基因的表达受到了霍乱毒素、百日咳毒素、GTPγS、GDPβS和苏拉明等处理的影响。在烟草中过表达桑树G蛋白信号,分析其对转基因植株抗性的影响。结果显示过表达MaGα和MaRGS降低了植株的抗盐抗旱性,过表达MaGβ、MaGγ1和MaGγ2提高了植株的抗盐抗旱性。测定胁迫条件下的生理指标发现,过表达MaGα和MaRGS降低了植株的ROS清除能力,过表达MaGβ、MaGγ1和MaGγ2提高了植株的ROS清除能力。以上工作全面地解析了G蛋白信号途径基因对干旱和盐胁迫响应的调控模式并阐明了其在拟南芥等植物中的研究结果存在争议的调控模式。分析还发现NaCl和PEG处理桑树和烟草后,其可溶性糖含量显著提高。桑树和烟草的WNK和ATG基因的表达量不同程度受到NaCl、甘露醇和葡萄糖处理的调控,这些基因在野生型和转基因烟草中对葡萄糖的敏感性有所不同,在MaGα过表达转基因烟草中对葡萄糖的敏感性有所降低,在其它过表达转基因材料中的敏感性有所增强,表明葡萄糖和细胞自噬可能参与了G蛋白信号介导的植物非生物胁迫响应。通过以上工作和结合前人研究,解决了植物G蛋白响应干旱和盐胁迫研究的一些争议问题,并推测了一个新的G蛋白响应胁迫的分子途径,即当植物遭遇干旱和盐胁迫后,葡萄糖含量增加,诱导内吞途径蛋白ATG的积累,同时招募WNK,导致RGS发生内吞,解除其对α亚基的GTP水解活性的促进作用,G蛋白三聚体解离加速,更多的βγ二聚体被解离出来,激活下游胁迫响应蛋白,提高植物ROS清除能力,从而引起植物对干旱和盐胁迫的响应。该途径还有待进一步阐明。3、桑树RACK1响应非生物胁迫的分子机理研究在拟南芥中过表达MaRACK1降低了转基因幼苗的抗盐抗旱性,降低了转基因种子在胁迫下的萌发率,并影响了根的发育,胁迫条件下的转基因拟南芥中的丙二醛(MDA)含量显著高于野生型植株,脯氨酸含量显著低于野生型植株。以上结果表明,MaRACK1是植物干旱和盐胁迫响应的负调控因子。通过Y2H、Y3H和BiFC等技术证实桑树和拟南芥中的RACK1都无法与其对应的G蛋白和RGS相互作用,证实了植物的RACK1可能不依赖于G蛋白而调控植物响应干旱和盐胁迫。此外,我们的实验也证实MaRACK1无法与MAPK途径的蛋白发生相互作用,而MaMAPK3、MaMAPK5、MaMKKK1和MaMKKKA与G蛋白βγ二聚体能够直接发生相互作用,证明G蛋白可以直接与MAPK途径蛋白相互作用,并不需要RACK1的支架蛋白作用,表明RACK1并不是G蛋白信号途径的成员。以上工作与Cheng等~([91])提出的RACK1介导G蛋白和MAPK级联的连接实现胁迫信号传递的路径有些出入,还完善了植物G蛋白信号传递到MAPK级联信号途径的关键途径。基于ePlant(http://bar.utoronto.ca/eplant/)数据库数据,分析了拟南芥中的基因表达情况。结果显示,AtRACK1A、AtRACK1B和AtRACK1C基因的表达量受到了干旱和盐胁迫不同程度地抑制,促进RACK1降解的AtWNK8的编码基因表达量在干旱和盐胁迫处理3 h后受到了抑制,负责维持RACK1稳定性的AtSUMO1蛋白的编码基因表达量受到干旱和盐胁迫显著的抑制。表明非生物胁迫可能导致了RACK1在转录水平的下调表达和蛋白水平的降解,从而使得植物作出适应性表现。通过转录组分析发现ERF、NAC、WAKY、bHLH等转录因子的基因表达受到了MaRACK1过表达的影响,它们也可能受到了RACK1的反馈调节,参与了胁迫条件下RACK1在转录水平的下调表达。通过转录组分析发现RACK1可能通过影响Peroxidase、LEA、Cytochrome P450、glutathione S-transferase和HSF等胁迫响应蛋白的积累来调控植物非生物胁迫响应。在这些被MaRACK1调控的基因中,ERF家族的RAP2-6(AT1G43160)已被证明能够与拟南芥AtRACK1B直接发生相互作用且其与CE1和GCC顺式元件的结合能力受到了AtRACK1B的影响,AtLTP4(AT5G59310)、AtLTP(AT2G10940)和GLP3(AT5G20630)等3个基因的编码蛋白也能够与RACK1相互作用,它们在植物非生胁迫响应中的功能还有待验证。发现参与茉莉酸合成和信号途径的部分基因表达量受到了MaRACK1的调控,在桑树中筛选到了一个MaTIFY 10A(又名MaJAZ1)与MaRACK1相互作用,推测RACK1可能通过茉莉酸途径影响植物的抗逆性。在桑树分析发现了一个捕光叶绿素a/b结合蛋白(MaCP24)和一个果糖-二磷酸醛缩酶(MaFBA)可与MaRACK1发生相互作用,它们的编码基因的表达都对胁迫比较敏感,在拟南芥中的同源蛋白AtCAB1(AT1G29930)、AtCAB3(AT1G29910)和AtFBA3(AT2G01140)也被发现可与拟南芥RACK1相互作用,表明这些蛋白可能在植物胁迫响应有一定的作用。以上结果都表明RACK1不能介导G蛋白和MAPK级联信号途径的连接,并根据这些结果提出了非生物胁迫诱导RACK1在转录水平的下调表达和蛋白水平的降解可能实现植物适应胁迫的新途径。在正常情况下,RACK1通过影响胁迫响应蛋白的表达、茉莉酸信号传递和光合作用等过程负调控干旱和盐胁迫响应。在干旱和盐胁迫下,ERF、NAC、WAKY和bHLH等转录因子可能参与诱导RACK1的基因表达量降低,AtWNK8和AtSUMO1等蛋白积累的变化诱导了RACK1蛋白的降解,从而解除RACK1对植物胁迫适应性的影响。该途径还需要更多的工作进一步阐明。
【图文】：

发育状况[66-67]。拟南芥 RGS 突变体 rgs1 的叶片大小和胚轴长度均比野生型高，RGS1 过表株系相比野生型植株表现出更短的胚轴、更小的莲座叶和花期的延长[48]。图 1-1 异三聚体 G 蛋白的信号传递模型[47]Fig. 1-1 The working model of heterotrimeric G protein

第一章 文献综述组织变大，但会降低株高、穗长和粒重，此外，过表达 RGG1 和 RGG2 会改[66-67]。拟南芥 RGS 突变体 rgs1 的叶片大小和胚轴长度均比野生型高，RGS野生型植株表现出更短的胚轴、更小的莲座叶和花期的延长[48]。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S888.2
，

本文编号：2688949