基于转录组测序技术对圆唇散白蚁雌性工蚁向补充繁殖蚁转化过程中的基因表达研究

发布时间：2020-05-31 06:32

【摘要】：低等白蚁散白蚁属Reticulitermes的工蚁(worker)品级具有发育的可塑性,既可以终生维持为工蚁品级,也可以根据巢群需求分化成巢群的守卫者兵蚁,或者分化成为巢群的补充繁殖蚁。在圆唇散白蚁R.labralis(Hisa)中,当巢群发生隔离或者繁殖蚁缺失时,雌性老龄工蚁会经过两次蜕皮,历经前补充繁殖蚁(pre-neotenic reproductive,pre-NR)阶段发育成补充繁殖蚁(neotenic reproductives,NR),接替巢群的繁殖工作。目前关于雌性工蚁向补充繁殖蚁品级的分化调控机理以及功能性基因研究甚少。在本研究中,以圆唇散白蚁原始巢群的雌性老龄工蚁、隔离饲养三周的雌性老龄工蚁(isolated worker,IW)以及由隔离工蚁分化而来的雌性补充繁殖蚁为研究对象,使用RNA-Seq筛选出雌性工蚁向补充繁殖蚁转化调控的关键候选基因及其相关的代谢调控通路,揭示雌性工蚁向补充繁殖蚁转化过程中的基因调控。主要研究结果如下:1.Worker、IW和NR通过转录组测序共获得66.85Gb的Clean reads,每个样品的Q30均高于90.96%且GC含量在43.33%-44.91%之间,组装拼接后共获得112,954个unigenes,通过与数据库比对,其中有17,535个unigenes在四大数据库中均被注释,Nr注释unigene为40,073个,在Swiss-Prot数据库中比对得到29,540个unigenes,在KOG分类中,共获得有25,453个KOG功能注释,KEGG中共注释得到的unigene为20,116个。此次转录组测序首次完成了圆唇散白蚁worker、IW和NR数据库的构建,为散白蚁基因的功能研究、白蚁生长发育和品级分化等提供了丰富的基因数据库资源,并对揭示工蚁繁殖可塑性的机理提供了分子研究依据。2.使用edger软件对样本间的差异表达基因进行筛选,结果表明,worker与IW的差异表达基因为17,405个,IW与NR的差异表达基因为30,332个,worker与NR的差异表达基因为7,016个,此次分析结果为后期基因功能研究提供丰富的资源,也为工蚁转化过程中关键调控基因的筛选提供了参考数据。接下来使用STEM软件对worker、IW和NR的差异表达基因进行趋势聚类分析,结果表明,有38,070个差异表达基因聚类为8个表达模式,通过对差异表达基因聚类分析获得符合工蚁转化调控的显著趋势模块profile5,结合GO以及KEGG富集分析,筛选出Ras信号通路的Ras基因和Ca M基因以及白蚁特有的免疫基因Termicin和Transferrin作为关键的候选基因,通过对候选基因表达量的研究揭示工蚁转化为补充繁殖蚁的基因调控机理。3.使用q RT-PCR对worker、IW和NR的测序结果进行检测,筛选出5个Ras信号通路基因和7个免疫相关基因进行q RT-PCR分析,检测结果在雌性工蚁向补充繁殖蚁转化过程中基因的表达变化趋势与转录组测序的结果相符,表明本次测序获得的数据和分析结果真实可靠,可以用于后期生物学分析比较。4.Ras蛋白作为Ras基因的表达产物,在胞外信号刺激所产生的信号转导通路中处于重要位置。隔离工蚁通过外界环境隔离因子的刺激,使Ras基因的表达量显著升高,Ras基因在IW中的表达量约是worker的130倍(p0.05),NR的20倍(p0.05),并且测序结果显示Ras富集于profile5中的36条代谢通路,说明Ras基因在工蚁转化过程中对于传递细胞产生的生长分化信号起到重要的开关调控作用。根据Ras在果蝇和家蚕中的功能研究推测Ras在工蚁转化过程中的高表达可能促进蜕皮激素的分泌以及工蚁的生长。钙调蛋白(calmodulin,Ca M)可以启动DNA的合成并且促进细胞进入有丝分裂后期。工蚁在隔离饲养的过程中解除了性信息素对其抑制,通过q RT-PCR验证发现工蚁隔离一周(IW1)以后Ca M基因的表达量明显上调,隔离三周(IW)时达到最高,此时的表达量约是worker的333倍(p0.05),NR的47倍(p0.05),表明Ca M在工蚁的转化过程中促进细胞的生长。5.Termicin和Transferrin是白蚁特有的免疫基因,在NR中的表达量显著高于worker和IW,表明在圆唇散白蚁中的NR对于病原菌具有很强的抵抗力。实时定量结果验证的免疫相关基因在IW的表达量明显高于worker,表明在工蚁转化为补充繁殖蚁的过程中对于病原菌的抵抗能力增强。6.首次研究促性腺激素释放激素受体(gonadotrophin releasing hormone receptor,Gn RHR)基因在雌性工蚁向补充繁殖蚁转化中的表达动态变化,以工蚁为对照组对q RT-PCR实验数据进行分析,结果表明,在NR中的表达量显著高于worker和Pre-NR,约是worker的12倍(p0.05),Pre-NR的5倍(p0.05),说明Gn RHR在雌性工蚁转化过程中对性腺发育以及卵母细胞成熟具有重要的调节作用。通过本次转录组测序为工蚁向补充繁殖蚁的分化研究建立了丰富的基因数据库,本次对于雌性工蚁向补充繁殖蚁转化相关基因的研究,不仅揭示了工蚁向补充繁殖转化中基因之间的调控机理,也为后期建立靶标基因RNAi体系以及鉴定新基因的功能奠定了基础。此外,为研发白蚁防治的新型药物提供分子生物学依据。
【图文】：

圆唇散白蚁,巢群,原始繁殖蚁,品级

保幼激素的分泌比其他品级多[11, 12]。繁殖蚁的性腺发育已经成熟，在巢群责交配以及产卵。繁殖品级在巢群中的地位至关重要，，失去繁殖品级的巢群有巢群的灭亡，繁殖品级在保持旧巢群和创建新巢群中有重要的意义。根据繁殖和来源将其分为原始繁殖蚁和补充繁殖蚁（次级繁殖蚁）。2.1 原始繁殖蚁原始繁殖蚁是指最初建立巢群的蚁王与蚁后。在每年婚飞阶段由末龄若蚁转化翅成虫会飞出原来的巢群，与另一位异性有翅成虫配对组建新的巢群，在建巢其他白蚁的辅助，只有脱翅的蚁王和蚁后，此时它们需要自行取食并且参与巢以及觅食等活动，当巢群中工蚁数量增多时，蚁王和蚁后会专司繁殖后代，由来完成巢群的建巢以及抚育等工作。原始繁殖蚁在形态上保持成虫的特性（图 1为黑色并且色素沉淀较深、角质化程度较高，对于外界环境适应能力较强。原体型比其他品级要庞大，主要负责新巢群的繁衍生息。

路径图,品级,路径,白蚁

为巢群的发展起到至关重要的作用，无翅型繁殖蚁为巢群的发展以及扩建提供了有利的条件。1.2 白蚁的品级分化1.2.1 白蚁品级发育路径白蚁发育中通过蜕皮来完成品级间的转化，研究发现白蚁的蜕皮方式主要有以下三种方式：静止性蜕皮、渐进性蜕皮以及倒退性蜕皮。但是在白蚁的发育路径中有些白蚁不一定都经历这三种方式[2]。白蚁作为具有高度组织的社会性昆虫，其白蚁品级的可塑性和多样性是它的显著特征。在高等白蚁中不同品级之间的形态和功能截然不同，其发育模式较为稳定[27]，而在低等白蚁中为了确保巢群稳定和繁衍，各个品级之间可以进行灵活的转化[28]。如下以散白蚁属为例来阐述白蚁的品级分化路径，在鼻白蚁科的散白蚁属中，其分化路线主要以若蚁路线和无翅路线早期分支为特征，具体如图 2。
【学位授予单位】：西北大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q963

【参考文献】