养鸡场抗生素耐药菌及抗性基因污染规律研究

发布时间：2020-05-31 07:35

【摘要】：近年来,各类抗生素在畜禽养殖业中的大量乃至过量使用,致使环境中抗生素抗性细菌(Antibiotic resistance bacteria，ARB)和抗生素抗性基因(Antibiotic resistance genes ARGs)的污染正在加剧。作为环境中抗生素耐药菌和抗性基因的重要源头,畜禽环境中ARB和ARGs的相关研究较少,特别是养殖场空气环境中ARB和ARGs污染规律未见系统研究。针对以上不足,对北京地区某典型蛋鸡养殖场粪便,舍内外空气样本进行采集,对其中ARB的浓度,耐药性以及影响因素进行分析,在此基础上,考察了 ARGs污染种类和浓度。本研究结果将为养鸡场环境中ARB和ARGs对周围环境的危害评估和制定相应的控制措施提供基础依据。首先,我们采用6级撞击式采样器采集鸡舍内外空气,同时采集蛋鸡粪便,对其中的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、金黄色葡萄球菌(S)和总细菌(LB)浓度变化趋势及其可能的影响因素进行分析。通过K-B药敏纸片法对鸡场空气和粪便中MRSA对7大类14种抗生素,青霉素(PEN)、氨苄西林(AMP)、头孢哌酮(CFP)、链霉素(STR)、庆大霉素(GEN)、阿米卡星(AMK)、红霉素(ERY)、环丙沙星(CIP)、左氧氟沙星(LEV)、诺氟沙星(NOR)、四环素(TET)、强力霉素(DOX)、磺胺甲恶唑(SXT)、万古霉素(VAN)的耐药情况进行研究。运用微滴数字PCR(ddPCR)技术对鸡场舍内外空气和粪便样本中的6类22种抗生素抗性基因,β-内酰胺类(blaPSE,blaCTXM,blaTEM,blaOXA10,mecA),氨基糖苷类(aadAl,aadA2,strB,aac(6')-Ⅱ,aphA3),大环内酯类(mpha,mefA,ermA,ermB),磺胺类(suI1,su12,dfrA1),四环素类(tetG,tetW,tetQ),万古霉素(VanA,VanB)和两类基因整合子(intI1,intI2)进行定量分析。研究结果表明,空气和粪便中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌浓度平均浓度为4.31±4.56×102CFU·m-3和3.37±4.83×104CFU·m-3,占金黄色葡萄球菌比例分别为41.99%±26.99%和22.11%±20.06%。鸡舍内空气和粪便中总细菌浓度随蛋鸡的日龄增加而呈现线性升高;整体上,金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌浓度随日龄增加而增加,并受舍内温度和颗粒物浓度的影响。药敏实验结果表明,本次实验所分离到的MRSA和金黄色葡萄球菌对β-内酰胺类、氨基糖苷类、大环内酯类、喹诺酮类、四环素类均表现出显著的耐药性,对磺胺甲恶唑和阿米卡星敏感性较高,对多肽类的万古霉素则为完全敏感。粪便中的金黄色葡萄球菌和MRSA对头孢哌酮的耐药程度,随蛋鸡日龄的增加而下降,与蛋鸡日龄呈显著负相关,对诺氟沙星的耐药程度与蛋鸡日龄呈显著正相关,在蛋鸡日龄较小时表现出轻度耐药,到成年时期则出现高度耐药乃至完全耐药情况。抗性基因究结果显示,本研究所选取的6类ARGs的目标基因及两类基因整合子在鸡舍空气和粪便中大部分都可以被检测到。其中blaTEM、aadA1、aadA2、ermB、tetW、sulI2、sulI1为空气和粪便样品中检出率及丰度较高的基因。从各类抗性基因总量角度来看,依次排序为,氨基糖苷类 ＞ 四环素类＞β-内酰胺类＞ 大环内酯类 ＞ 磺胺类 ＞ 多肽类。所选取的六类ARGs中均有与移动基因元件(intI1、intI2)呈显著正相关的目标基因,且这种正相关性在粪便样本中检出较多,舍内空气样本次之。
【图文】：

２．１．１采样时间和地点逡逑本研宄在２０１６年７月？２０１６年１１月期间，对北京平谷地区一家规模化蛋鸡养殖场逡逑两栋鸡舍分别进行同时采样调查。具体坐标位置和养殖场内部环境，，如图２－１所示。鸡逡逑场所处位置地势平坦，其８００米辐射半径内不受较高建筑物及公路主千道影响。采样当逡逑日天气均为晴天。主要采集鸡舍内外样本和相应粪便样本。两栋鸡舍饲养品种均为海兰逡逑蛋鸡，所处环境及养殖方式相同，采取笼上养殖，每个鸡舍内蛋鸡数量均在９３００只左逡逑右，鸡舍采取机械通风，每周带鸡消毒２次。其中ａ、ｆ分别代表空气样本和粪便样逡逑本。逡逑卜邋■．逡逑（ａ）逦（ｂ）逡逑图２－１采样地点和鸡场内部示意图逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－１邋Ｔｈｅ邋ｍａｐ邋ｏｆ邋ｓａｍｐｌｉｎｇ邋ａｎｄ邋ｔｈｅ邋ｉｎｓｉｄｅ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｃｈｉｃｋｅｎ邋ｆａｒｍ逡逑２．１．２采样方法与培养方法逡逑生物气溶胶采集在清粪、喷淋消毒等作业开始前４０分钟完成。采集使用ＦＡ－邋ｌ撞逡逑击式采样器（辽阳，中国）。该仪器将空气中的带菌粒子按空气动力学直径人小分别捕逡逑捉在各级培养皿上，具体粒径分布信息如表１所示。采样高度距地面１．５ｍ｜ｆｔ６１，细菌与逡逑抗生素耐药菌样本采集时间经优化，分别为ｌｍｉｎ和２ｍｉｎ，气体流量２８．３邋１＾０１１１１＇每次逡逑－８邋－逡逑

逡逑随蛋鸡日龄的变化趋势，结果如图２－１所示。逡逑＾■ＭＲＳＡ／ＬＢ邋＾＾Ｓ／ＬＢ邋ｆ＾＼ｌ邋ＭＲＳＡ／Ｓ逡逑ｉ0２邋ｒ逦ｎ逡逑、逦Ｆ＾Ｉｍｒｓａ逦■！邋ｌｂ逡逑ｉ＇ｉｌｉｉｉｉｉｉｉ逡逑１４５ｄ逦１７６ｄ逦２０９ｄ逦２４４ｄ逦２７０ｄ逦３１邋Ｏｄ邋３４３ｄ逦３７８ｄ逦４０４ｄ逡逑浓鸡Ｕ龄逡逑图２－１鸡舍内部空气中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（ＭＲＳＡ）、金黄色葡萄球菌（Ｓ）和总细菌（ＬＢ）浓逡逑度及比值逡逑Ｆｉｇｕｒｅ２－邋１邋Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ邋ａｎｄ邋ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｓ邋ｏｆ邋ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ邋ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ邋ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）Ｎ逡逑ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ邋ａｕｒｅｕｓ（Ｓ）邋ａｎｄ邋ｔｏｔａｌ邋ｂａｃｔｅｒｉａ邋（ＬＢ）邋ｉｎ邋ａｉｒ邋ｏｆ邋ｌａｙｅｒ邋ｈｏｕｓｅ逡逑由图２－１可知，在蛋鸡日龄分别为１４５ｄ、４０４ｄ检出舍内环境总细菌气溶胶浓度最逡逑低值和最高值，即总细菌气溶胶浓度变化范围在0．１９ｘｌ0４？３．８ｘｌ0４ＣＦｌ＞ｉｒｆ３。整体来逡逑看，总细菌气溶胶浓度随日龄增加呈上升趋势。其中，日龄分别为２０９ｄ、２７０ｄ、３７８ｄ逡逑所检测到的总细菌气溶胶浓度相比临近日龄浓度略有下降，但浓度差异小于１个数量逡逑级。本研宄中所检测到的总细菌气溶胶浓度略低于莱芜市蛋鸡舍内浓度１１３］，相比山西地逡逑区某牛场０．２１邋ｘｌ0３？５．２６ｘｌ0３ＣＦＵ．ｍ－３和羊场０．３７＞＜１０３？５．５５ｘｌ0３ＣＦＵ．ｍ＿３中空气细菌浓度逡逑略高［７＼值得关注的是
【学位授予单位】：东北林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：X713

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本文编号：2689519