寡孢节丛孢产孢相关基因VosA、VelB和Acy的功能研究

发布时间：2020-05-31 11:59

【摘要】：寡孢节丛孢(Arthrobotrys oligospora)是捕食线虫真菌的代表菌株。其无性繁殖方式主要通过产生分生孢子,目前人们对其无性产孢机制及相关产孢基因的研究甚少。本论文以该真菌为实验菌株,以3个调控分生孢子形成的相关基因VosA(AOL_s00054g700)、VelB(AOL_s00054g811)和Acy(AOL_s00080g284)为研究对象,利用基因敲除和Real time PCR等分子生物学技术,初步探究了VosA、VelB和Acy蛋白在寡孢节丛孢生长发育、捕食器官形成和产孢等过程中的功能。主要实验结果:1.VosA、VelB和Acy蛋白的氨基酸序列和聚类分析对寡孢节丛孢3个产孢相关蛋白VosA、VelB和Acy的氨基酸序列和功能结构域进行分析,Acy蛋白的分子量较大,含有2100个氨基酸,VosA蛋白和VelB蛋白的分子量相对较小分别含有497个和335个氨基酸,VosA和VelB属于velvet家族蛋白,它们都含有2个保守的结构域:Velvet factor结构域(IPR021740)和Velvet结构域(IPR037525)。Acy蛋白的保守结构域较多,含有Adenylyl cyclase class-3/4/guanylyl cyclase(IPR001054)和Leucine-rich repeat(IPR001611)等8个结构域。聚类分析表明,VosA、VelB和Acy分别与构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的同源蛋白的亲缘关系较近。2.VosA、VelB和Acy基因的敲除及表型研究利用同源重组的方法,成功获得了VosA、VelB和Acy的敲除突变菌株,并对它们的表型特征进行了比较,包括菌落形态、生长速率、孢子数量及形态、捕器的形成和数量以及胞外蛋白酶的活性等。结果发现ΔAcy突变株的生长速率比野生型菌株慢且气生菌丝较弱,菌丝形态发生改变,不能产生孢子和三维菌网,胞外蛋白酶活性显著下降;ΔVelB突变株生长速率明显比野生型慢且菌落变得稠密,气生菌丝明显减少,菌丝形态发生改变,不能产生孢子,三个转化子中有一个产生捕器但捕器数量减少,胞外蛋白酶活性下降;而ΔVosA突变株与野生型相比表型无明显变化。3.寡孢节丛孢野生菌株、ΔVelB和ΔAcy突变菌株中部分表型相关基因的定量分析收取分别培养3、5和7天的ΔVelB和ΔAcy突变株和野生型菌株样品,提取总RNA,反转录成cDNA。选取与产孢、抗逆性以及胞外蛋白酶等表型差异相关的部分基因进行RT-PCR分析,在ΔVelB突变株中,产孢、抗逆性和胞外蛋白酶相关基因的转录水平相对野生型菌株有较大的变化,且大部分都是降低的,与VelB突变株的表型相符。在ΔAcy突变株中,产孢、抗逆性和胞外蛋白酶相关基因的转录水平相对野生型菌株有较大的变化,大部分在第3和5天下降,在第7天恢复到野生型的转录水平。说明VelB和Acy蛋白参与寡孢节丛孢的产孢、抗逆性和致病性等生物学过程的调控。本论文的创新性:1.敲除了寡孢节丛孢中三个产孢调控相关蛋白(VosA、VelB和Acy)的编码基因,对野生菌株和敲除突变株的生物学表型进行了较系统的比较,发现VelB和Acy蛋白参与寡孢节丛孢的生长、产孢、抗逆性和致病性等生物学过程的调控。2.利用荧光定量PCR,比较ΔVelB和ΔAcy突变株和野生菌株在产孢、细胞壁合成、抗氧化和胞外蛋白酶等差异表型相关基因的转录水平,对VelB和Acy参与寡孢节丛孢产孢、抗逆性以及胞外蛋白酶生产的调控机制进行了初步的分析。
【图文】：

构巢曲霉产孢示意图

寡孢节丛孢产孢相关基因VosA、VelB和Acy的功能研究

构巢曲霉产孢的遗传调控模式图
【学位授予单位】：云南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q933

【参考文献】