无抗性选择标记转OsSSSⅡ-2基因RNA干扰结构水稻的品质分析及其分子特性研究

发布时间：2020-05-31 18:46

【摘要】：水稻是世界上主要的粮食作物之一,目前世上超过一半的人口以稻米为主食。而淀粉是稻米胚乳最主要的成分,决定着稻米的品质。因此,我们可通过调控水稻淀粉合成相关基因的表达,来改良稻米的食味品质。可溶性淀粉合成酶(SSS)是由多基因家族编码,根据氨基酸同源性,可将SSS分为SSSⅠ、SSSⅡ、SSSⅢ以及SSSⅣ等4个亚家族,水稻中SSSⅡ有三种同工型,SSSⅡ-1、SSSⅡ-2和SSSⅡ-3。本研究是对本实验室已获得的无抗性选择标记基因的转OsSSSⅡ-2基因RNA干扰结构水稻的中间试验,以进一步研究其品质性状及分子特性,结果如下:1.Real-time PCR分析结果表明,OsSSSⅡ-2基因在转基因水稻中的表达量较受体亲本明显降低。2.通过对成熟稻米的品质分析表明,转基因水稻的直链淀粉含量较受体亲本都是极显著降低并与南粳46相当,其胶稠度也都是极显著增加,说明转基因水稻米质变软。3.通过淀粉粘滞性谱分析结果表明,转基因水稻的糊化温度都有所降低,其中崩解值相对亲本都有所增加,消减值与回复值与亲本相比都要明显降低,说明米质与亲本相比变软、更易糊化、有弹性,与南粳46相近,表明稻米的食味品质得到了改善。4.通过米饭食味计测定和蒸煮食味品尝结果表明,转基因水稻的光泽、口感、外观以及粘度都有所提升并且适口性和冷饭质地均有所改善,与南粳46接近,说明转基因稻米的蒸煮食味品质得到了改良。5.对成熟水稻农艺性状调查结果表明,除转基因水稻的千粒重及部分转基因株系的株高与受体亲本相比有极显著降低之外,其他农艺性状较受体亲本没有明显变化,原因可能是影响了淀粉合成后对千粒重产生影响。同时转基因水稻的外观品质与受体亲本相比无明显变化,且优于南粳46。6.实时荧光定量PCR结果表明五个独立转化子来源的转基因水稻目的基因插入均为单拷贝。7.通过反向PCR的方法确定了 SSSⅡ-2-5、SSSⅡ-2-13和SSSⅡ-2-23这三个转化子外源基因的插入位点,其目的基因插入位点分别在水稻第2、11和5号染色体上。
【图文】：

双元载体

徐志豪：无抗性选择标记转ＱｓＳ怒／／－２基因ＲＮＡ干扰结构水稻的品质分析及其分子特性研宄逦１７逡逑二、材料与方法逡逑２．１实验材料逡逑本研宄所用水稻材料为抗条武运粳８号、ＳＳＳＩＩ－２－５、ＳＳＳＩＩ－２－９、ＳＳＳＩＩ－２－１３、ＳＳＳＩＩ－２－２３、逡逑ＳＳＳｎ－２－１６、以及两个软米品种南粳邋４６邋（ＮＪ４６）。其中邋ＳＳＳＩＩ－２－５、ＳＳＳＩＩ－２－９、ＳＳＳＩＩ－２－１３、逡逑ＳＳＳＩＩ－２－２３和ＳＳＳＩＩ－２－１６为不含抗性选择标记基因的转Ｍ５／／－２基因ＲＮＡ干扰结构水稻，逡逑是以粳稻抗条武运粳８号为受体、经根癌农杆菌介导超双元载体法转化获得的共转化植株逡逑后代中筛选出的。本研宄使用这８个水稻材料进行小区种植，每个小区１00苗，每个小区逡逑种植３个重复。图２．１．１为用于共转化的超双元载体的Ｔ－ＤＮＡ区。逡逑

侧翼序列,特异序列

本实验是采用反向ＰＣＲ和ＴＡＩＬ－ＰＣＲ技术相结合的方式扩增转基因水稻中Ｔ－ＤＮＡ区逡逑的侧翼序列，在Ｔ－ＤＮＡ的ＬＢ端酶切位点前设计三对巢式引物（ＳＰ１和ＳＰ２、ＳＰ３和ＳＰ４、逡逑ＳＰ５和ＳＰ６，引物序列的位置见图２．６），分别用这三对引物进行三轮ＰＣＲ扩增外源片段。逡逑然后取适量扩增产物和水稻基因组ＤＮＡ进行酶切，酶切体系为３0４，其中ＤＮＡｄｕｇ／ｐｌ）逡逑２￣４ｎｌ，扩增产物４ｎｌ，ｌ0ｘｂｕｆｆｅｒ３ｊｉｌ，酶１？３ｎｌ，剩余用ｄｄＨ２０补足。反应条件为：温度逡逑依酶而定，３￣５ｈ，邋７２°Ｃ失活ｌＯｍｉｎ，取５０酶切产物，用１％琼脂糖凝胶电泳检测。然后将逡逑产物进行回收、纯化和连接。纯化步骤为：①加入１／１０体积的３Ｍ醋酸纳（ＰＨ５．２）和２逡逑倍体积的冷无水乙醇，一２０°Ｃ，ｌｈ；②０°Ｃ，邋１４０００ｒｐｍ，离心３０ｍｉｎ；③弃上清，，加ｌｍｌ逡逑乙醇（７０％），０°Ｃ，１２０００ｒｐｍ，离心ｌＯｍｉｎ；④弃上清，空气中干燥。⑤加１０｜Ｌｉｌ邋ＴＥ１．０溶逡逑解。酶切产物的连接体系为３0４，其中ｄｄＨ２０邋１６４，邋Ｔ４邋ＤＮＡｌｉｇａｓｅｌｕｌ，ＤＮＡ邋１（＾１，邋１０逡逑ｘＴ４邋ＤＮＡ邋ｌｉｇａｓｅ邋ｂｕｆｆｅｒ邋３ｐｌ。反向邋ＰＣＲ邋第一轮扩增引物为邋５７１－Ｓ１邋ＴＣＴＡＧＴＡＡＣＡＴＡ逡逑
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S511

【参考文献】