非洲狗牙根CtHsfA2b基因耐热功能研究

发布时间：2020-06-01 06:33

【摘要】：非洲狗牙根(Cynodon transvaalensis Burtt-Davy)是暖季型草坪草,广泛应用于杂交狗牙根育种。作为固着生物,植物在高温条件下必须构建专门的防御系统来维持自身生长及后代繁衍。作为热信号传导链的终端组件,热激转录因子能够结合到其下游热诱导基因启动子的热激元件上,调控下游基因转录活性,在热激响应中发挥主要作用,其中热激转录因子A2(HsfA2)是植物响应高温过程中的关键调控因子。本研究从非洲狗牙根中分离出HsfA2基因(CtHsfA2b),在拟南芥中过量表达,研究HsfA2基因介导的耐热生理功能,并通过下游基因表达分析研究此热激转录因子调节耐热性的分子机理,为冷季型草坪草耐热性育种奠定基础。本研究主要结果如下:1从非洲狗牙根中分离出HsfA2基因的cDNA序列,包括1386 bp核苷酸,1095 bp ORF编码365个氨基酸。从氨基酸序列同源比对和聚类分析可以看出:CtHsfA2b基因同小米、水稻及二穗短柄草中HsfA2b基因的序列相似度极高,该基因属于热激转录因子A2b亚组,我们将其命名为非洲狗牙根HsfA2b基因(CtHsfA2b,GenBank登录号:KU156630)。2构建了 CtHsfA2b-eGFP质粒并将重组质粒转入拟南芥叶肉原生质体,DAPI和GFP的荧光信号完全重叠在细胞核说明CtHsfA2b定位在细胞核。CtHsfA2b转基因拟南芥的植物表达载体pEarleyGate 103中也有一个GFP编码区域,通过观察转基因植株根尖细胞,进一步验证CtHsfA2b蛋白定位于细胞核。3非洲狗牙根中叶和根的qRT-PCR分析结果显示:CtHsfA2b基因迅速响应热胁迫,在42℃热处理30min内表达水平持续上升,到lh时达到最高水平。CtHsfA2b基因在叶片中的表达比在根中更高,响应也更早。基因表达达到最高水平后逐渐下降并在恢复30℃正常生长温度后回落到初始水平。4构建CtHsfA2b基因表达载体并将它转入WT和热敏感拟南芥突变体hsfa2中进行过量表达分析:CtHsfA2b基因及其GFP融合蛋白在35S:CtHsfA2b和35S:CtHsfA2b/hsfa2中均有表达,但在hsfa2突变体及WT中均不表达。对比WT及hsfa2突变体拟南芥,CthsfA2b基因过表达拟南芥在高温胁迫下表现出更高的存活率,净光合速率、光化学效率和叶绿素含量提高,电解质渗漏率降低,说明CtHsfA2b过量表达提高了拟南芥幼苗的耐热性。5检测热胁迫后恢复阶段相关数据,由于hsfa2突变体从热胁迫中释放出来之后一直不能得到恢复,我们认为热处理对hsfa2突变体来说是致死的,但是对WT和35S:CtHsfA2b/hsfa2伤害却很小,说明CtHsfA2b过量表达能够拯救hsfa2突变体的热敏感缺陷,并使其耐热性恢复到野生型的水平。6转CtHsfA2b基因植株还表现出对一系列下游基因的转录调控,包括提高编码抗坏血酸过氧化物酶基因(AtApx2)和热休克蛋白基因[AtHsp18.1-CI,AtHsp22.0-ER,AtHsp25.3-P and AtHsp26.5-P(r),AtHsp70b and AtHsp101-3]的转录水平,高温诱导这些基因表现出典型的热应答特征。7热胁迫处理1小时后,活性氧组分O2-和H2O2在WT中的积累高于在转基因植株中的积累,说明转基因株系的抗氧化能力得到增强,AtApx2可能起到了重要作用。通过酵母单杂交(Y1H)及荧光素酶(LUC)实验进一步表明,CtHsfA2b基因可以结合到位于AtApx2基因启动子的热激元件(HSE)上,从而加强报告基因的转录活性。以上结果表明,CtHsfA2b基因受热诱导,在高温胁迫下迅速表达,通过上调抗氧化及分子伴侣防御机制,从而发挥热保护作用。CtHsfA2b基因有潜力作为候选基因发挥作用,为冷季型草坪草耐热性改良育种奠定基础。
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S688.4

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