草鱼IL-17家族基因的克隆及其在肠道炎症中的功能鉴定

发布时间：2020-06-01 10:14

【摘要】：目的:白细胞介素-17家族(IL-17s)成员是一类促炎细胞因子,主要由辅助性T细胞T_H17分泌,在宿主防御以及各种自身免疫性疾病中发挥重要作用。草鱼是一种鲤科草食性鱼类,是我国重要的淡水养殖品种,但其易受病原菌侵袭,产生炎症甚至死亡。肠道是重要的粘膜免疫组织,因常与腔内致病因子接触,肠粘膜易受感染。本研究旨在克隆草鱼IL-17家族基因,分析其基因结构,检测其在生理及病理条件下各组织中的表达水平,并对其在肠道炎症中的作用进行初步鉴定。方法:运用快速扩增cDNA末端技术及常规PCR技术从草鱼中克隆IL-17家族基因的蛋白编码区序列。运用生物信息学方法分析基因的结构、编码的氨基酸序列、分子演化特征。运用实时荧光定量PCR(qPCR)技术检测健康草鱼及嗜水气单胞菌刺激下各组织中IL-17家族基因的表达水平。通过肛灌及腹腔注射嗜水气单胞菌的方法建立草鱼肠道炎症模型,观察细菌感染后肠道的病理变化,检测肠道中IL-17家族基因在感染后第1、3和7天时的相对表达量。结果:我们鉴定了草鱼的IL-17A/F2、IL-17A/F3、IL-17C、IL-17N基因。草鱼IL-17A/F2、IL-17A/F3、IL-17C和IL-17N的蛋白编码区序列长分别为420、474、489和411 bp,分别编码139、157、162和136个氨基酸,均包括3个外显子,2个内含子。基于氨基酸序列构建的系统进化树显示,草鱼IL-17家族基因(IL-17A/F1、IL-17A/F2、IL-17A/F3、IL-17C、IL-17D、IL-17N)与其他脊椎动物相对应的IL-17基因为一支,且与斑马鱼、鲤鱼一致性较高。qPCR分析结果显示,IL-17家族在各个组织中都有表达,但组织间的表达量存在较大差异。IL-17A/F1、IL-17A/F2、IL-17A/F3、IL-17D在血液中表达量最高,IL-17C在心脏中表达量最高,而IL-17N则在肌肉、皮肤、脑中表达量较高;所有基因在脾脏、头肾、体肾中表达量较低。腹腔注射嗜水气单胞菌24 h后,IL-17家族基因在不同组织中的表达量发生了变化,其中在肠道组织中均显著上调。采用腹腔注射和肛灌嗜水气单胞菌的方式均可使草鱼出现炎症反应。其中,腹腔注射嗜水气单胞菌可导致包括肠道在内的全身性炎症并产生腹水,而肛灌嗜水气单胞菌主要引起肠道的炎症。肠道病理切片显示,腹腔感染后第3天肠道炎症最为严重,肠绒毛出现缺损现象;感染后第7天肠道粘膜层炎性细胞明显减少。与腹腔感染相比,肛灌感染引起的肠道炎症相对较弱,但肠道炎症症状最明显的时间也出现在肛灌感染的第3天。qPCR结果显示,腹腔注射感染后,IL-17A/F2、IL-17C持续上调表达,IL-17D在7天内始终高表达,而IL-17A/F1、IL-17A/F3与IL-17N则表现为第1、7天显著上调,第3天上调幅度较小甚至下调。肛灌嗜水气单胞菌后的第1天,除IL-17D外,其余5个基因上调显著;第3天的表达趋势不同,其中IL-17A/F1、IL-17A/F3、IL-17C上调达显著水平,IL-17A/F2、IL-17D、IL-17N表达量基本回复到正常水平;第7天时,IL-17家族六个基因均上调。结论:克隆并鉴定了草鱼IL-17A/F2、IL-17A/F3、IL-17C、IL-17N基因。腹腔注射与肛灌嗜水气单胞菌后引起的肠道炎症中,草鱼IL-17(IL-17A/F1、IL-17A/F2、IL-17A/F3、IL-17C、IL-17D和IL-17N)均产生了免疫应答,起到重要的调节作用,但各种基因调节方式有所差异。其中,IL-17N在嗜水气单胞菌感染24 h后上调幅度最大,在草鱼肠道炎症发生前期发挥明显的促炎作用,IL-17N基因可用于炎症早期诊断。
【图文】：

1.3 无脊椎动物 IL-17 基因无脊椎动物也有IL-17基因的存在，目前已从太平洋牡蛎(Crassostreaas)[35,40]、三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）[36]、合浦珠母贝（Pinctada fucata）[3海鞘（Ciona intestinalis）[38]中发现了IL-17基因。2 IL-17 受体2.1 哺乳动物 IL-17 受体1995年，Yao发现了IL-17A的受体IL-17RA，这是第一个被发现的IL-17受体[22,41现的IL-17受体家族成员有五个（如图1），分别是IL-17RA、IL-17RB、IL-17R17RD、IL-17RE，所有的家族成员都位于22号染色体，并且都是一型单次跨膜蛋保守结构基序，包括一个胞外的类纤维结合素结构域和一个胞内的SEF/IL-17R2-43]。IL-17受体家族成员之间可以同源二聚体或异源二聚体的形式组合为不同的物，IL-17RA作为这个家族里最大的分子，是至少四个配体传递信号的通用亚

图 2 IL-17A 与 IL-17F 的来源及其作用机制[30]2000年，，IL-17A的同源基因IL-17C被克隆出来。目前，关于IL-17C在小鼠肠膜免疫反应中的作用较为明确[45]。当用IL-17C处理体外培养的小鼠原代野生型道上皮细胞时，IL-17C可与其受体IL-17RE结合，激活NF-κB和MAPK信号通路下游传递信号[48]。在小鼠遭遇鼠柠檬酸杆菌（Citrobacter rodentium）感染时，道细胞中IL-17C上调，进一步研究发现，Flagellin、LPS等入侵宿主的病原菌AMP分子可以使肠道上皮细胞产生IL-17C，此外TNFα和IL-1β等病原菌激活的因子也可使上皮细胞产生IL-17C。在感染早期，宿主IL-17C与IL-22会上调，IL-17C和IL-22两种细胞因子处理体外培养的肠道上皮细胞时，细胞内的100A8、S100A9及Reg3γ等抗菌基因上调百倍。这表明，IL-17C和IL-22在宿主早期共同发挥抗菌作用[49]。Fort等基于IL-17A序列，从人和鼠的基因组中鉴定了IL-17A的同源基因IL-即IL-17E）[50]。肺和肠道上皮细胞、Th2细胞、脑内皮细胞、肺部的嗜酸性粒
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S943

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本文编号：2691330