枝状枝孢霉MD2紫杉醇合成相关候选基因A10182和A10251的超表达分析

发布时间：2020-06-02 14:24

【摘要】：紫杉醇是一种高效的抗癌药物,目前主要从红豆杉中提取,但由于红豆杉资源匮乏导致其药源紧缺。利用内生真菌发酵生产紫杉醇是最有前景的替代途径之一。然而,目前发现的产紫杉醇内生真菌的紫杉醇产量较低,均不具备大规模生产的价值。通过对真菌紫杉醇代谢途径的定向遗传改造,超表达紫杉醇合成限速酶基因和调控基因是获得紫杉醇高产基因工程菌株的主要途径之一。但目前关于真菌紫杉醇的合成途径及其相关基因知之甚少,因此克隆真菌紫杉醇合成相关基因并明晰其功能,是揭示真菌紫杉醇合成途径以及利用基因工程技术提高真菌紫杉醇产量的关键。本文从产紫杉醇内生真菌枝状枝孢霉MD2中克隆候选基因A10182和A10251,并通过超表达技术分析这两个候选基因对枝状枝孢霉MD2紫杉醇及其他5种紫杉烷类合成的影响,为后期深入研究候选基因A10182和A10251的生物学功能奠定了基础。取得主要研究成果如下:(1)克隆了候选基因A10182和A10251的DNA全长序列并进行生物信息学分析。候选基因A10182和A10251长度分别为678 bp和906 bp,编码产物分别与Endocarpon pusillum的假定蛋白(GenBank no.XP007808865.1)和Pseudocercospora muase的假定蛋白(GenBank no.KXT16021.1)同源性最高。A10182和A10251的编码蛋白均为疏水性蛋白,不含有二次跨膜结构和信号肽。A10182的编码蛋白共有225个氨基酸,分子量为24.984 kDa,共有4个α螺旋、10个延伸链。A10251的编码蛋共有301个氨基酸,分子量为33.320 kDa,共有3个α螺旋、1个延伸链。(2)成功构建了候选基因A10182的超表达载体pTFCM-A10182,采用农杆菌介导法转化枝状枝孢霉MD2,并通过平板抗性筛选和抗性基因hph的扩增检测,共获得23株A10182-转基因菌株。随机挑取13株转基因菌株进行Southern blot分析,结果表明:13株A10182-转基因菌株的外源基因是以单拷贝方式与宿主染色体DNA整合;随机选择其中3株并采用qRT-PCR技术检测候选基因的表达量,结果表明:与对照菌株(未转基因)相比,3株转基因菌株中候选基因的表达量均增加,其中转基因菌株AC的A10182表达量最高,约是对照的2.0倍。HPLC检测结果表明:与对照菌株的紫杉醇(5.033±0.132μg/g)、10-去乙酰巴卡亭III(15.062±0.304μg/g)、10-去乙酰紫杉醇(4.044±0.089μg/g)、7-木糖-10-去乙酰紫杉醇(2.387±0.059μg/g)产量相比,A10182-转基因菌株AC的紫杉醇(5.187±0.016μg/g)、10-去乙酰巴卡亭III(20.411±0.335μg/g)、10-去乙酰紫杉醇(4.518±0.091μg/g)、7-木糖-10去乙酰紫杉醇(3.434±0.061μg/g)的产量均有所提高;并且A10182-转基因菌株AC中检测到多烯紫杉醇,产量约为2.709±0.106μg/g。该结果预示超表达候选基因A10182对枝状枝孢霉MD2上述紫杉烷类的合成有促进作用。(2)构建候选基因A10251的超表达载体pTFCM-A10251并转化枝状枝孢霉MD2,共获得30株A10251-转基因菌株。随机挑选14株转基因菌株进行Southern blot检测,结果表明:4株A10251-转基因菌株AC、AV、AH、AE中的外源基因是以单拷贝方式整合到宿主染色体DNA;qRT-PCR检测结果表明:与对照菌株相比,A10251-转基因菌株AC的候选基因表达量最高,约为对照的2.0倍。HPLC检测结果表明:与对照菌株的紫杉醇(5.033±0.132μg/g)、10-去乙酰巴卡亭III(15.062±0.304μg/g)、10-去乙酰紫杉醇(4.044±0.089μg/g)、7-木糖-10-去乙酰紫杉醇(2.387±0.059μg/g)产量相比,A10251-转基因菌株AC的紫杉醇(6.022±0.116μg/g)、10-去乙酰巴卡亭III(22.304±0.442μg/g)、10-去乙酰紫杉醇(4.209±0.097μg/g)、7-木糖-10去乙酰紫杉醇(3.378±0.074μg/g)的产量均有所提高;并且转基因菌株AC中检测到了多烯紫杉醇,产量约为1.983±0.094μg/g。该结果预示超表达候选基因A10251对枝状枝孢霉MD2上述紫杉烷类的合成有促进作用。
【图文】：

紫杉醇,抗癌作用

、皂苷等[1,2]。紫杉醇（Paclitaxel，商有抗癌作用的异戊烯类次生代谢 853.92，系统名为 5β,20-环氧-1,2酯-2-苯甲酸酯-13-（2’R，3’S）-N- 与 Wall 同 Andre T. Mcphail 阐明其二萜组成的碳环基本骨架及一个苯分[4]。紫杉醇具有独特的抗癌作用双聚体的装配而维持微管蛋白稳定阻滞于 G2/M 期从而抑制癌细胞的批准紫杉醇用于治疗卵巢癌，，随后发现的产紫杉醇植物除红豆杉，还

转录组,枝孢霉,生物信息学软件,生物信息学分析

2.3.3 候选基因 A10182 和 A10251 的生物信息学分析采用 Blastp、ProtParam、ProtScale、TMHMM、SignalP 4.1、PsiPred 和 SMART 在线生物信息学软件分别对 A10251 和 A10182 编码蛋白进行分析。2.4 结果与分析2.4.1 候选基因 A10182 和 A10251 响应 MeJA 诱导的表达特征本研究在前期实验室采用 RNA-Seq 技术进行的枝状枝孢霉 MD2 响应 MeJA 诱导不同时间点（0 h、6 h、12 h、18 h、24 h、30 h）的转录组测序的基础上，选取响应茉莉酸甲酯（MeJA）诱导表达量变化明显（图 2.1）的 UnigeneA10182 和 A10251 为本研究的候选基因。
【学位授予单位】：中南民族大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q93;Q78

【参考文献】