玉米氨基酸转运蛋白ZmAAP基因的克

发布时间：2020-06-03 00:34

【摘要】：氨基酸转运蛋白AAPs基因在拟南芥中被首次发现,经大量实验结果证明拟南芥中AAPs基因对植株体内氨基酸的种类和数量起到调控作用。越来越多的科学家证明了AAPs基因主动参与一些植物体内营养物质的吸收及代谢产物的转运。但在玉米中关于AAP基因的研究鲜见报道,因此,本研究旨在从玉米中克隆出AAP基因并探究其功能,从而明确玉米中AAP基因的表达与氨基酸吸收的关系,为玉米吸收氨基酸分子机制的研究提供理论基础,并为今后创造氨基酸吸收含量高的新玉米材料提供理论依据和候选基因。本研究克隆了玉米ZmAAP基因,并通过本底表达和真核表达对该基因的功能进行了初步分析,主要结果如下:1.采用同源克隆技术得到玉米中一段未知功能基因片段1396bp。运用生物信息学对该基因序列进行分析,采用RT-PCR技术克隆得到该玉米未知功能基因片段1396bp。运用生物信息学对该序列进行分析,可知该未知功能基因编码区核苷酸序列与大麦AAP1基因的相似性最高,相似度为87%,初步证明从玉米中克隆的基因可能为AAP基因的核酸序列,命名为ZmAAP。ZmAAP基因全长cDNA序列包括1212bp的开放阅读框,ZmAAP基因编码的氨基酸序列氨基酸数403个,相对分子质量42.88KDa,理论等电点9.24,正、负电荷残基总数分别是18和30,在组成ZmAAP蛋白编码的20种氨基酸中丝氨酸所占比例最高,达到13.4%,而组氨酸所占比例最低,仅为1.0%,总平均亲水性为0.220。ZmAAP蛋白包含信号肽,剪切位点位于38,39残基处;有5个跨膜区。2.通过荧光定量PCR测定不同生育期(出苗期、拔节期、大喇叭口期、抽雄期、吐丝期、乳熟期、完熟期)玉米植株和不同成熟度(10天、20天、30天、40天、50天、60天)玉米种子中ZmAAP基因的组织表达情况。同时测定了不同生育期玉米植株和不同成熟度种子中总游离氨基酸含量、可溶性蛋白含量、20种氨基酸组分这三个生理生化指标,发现在玉米根、叶、种子中总游离氨基酸含量与ZmAAP基因表达量的变化趋势相一致。在玉米叶、种子中可溶性蛋白含量与ZmAAP基因表达量的变化趋势相一致。ZmAAP基因在玉米根、叶、种子中表达量最高的时期相应部位碱性氨基酸含量均增速加快。后经生理生化指标与ZmAAP基因表达量之间的相关性分析表明玉米根、叶、种子中ZmAAP基因的表达量与总游离氨基酸含量呈显著正相关性,玉米叶和种子中ZmAAP基因的表达量与可溶性蛋白含量呈显著正相关性,因此初步确定ZmAAP基因的表达能够影响氨基酸和蛋白质的含量。3.通过构建植物表达载体pCAMBIA3301-ZmAAP后经农杆菌介导的方法将ZmAAP基因导入拟南芥,再经除草剂筛选从而获得转ZmAAP基因拟南芥,获得T2代转基因拟南芥25株。以T2代转基因型拟南芥为实验材料,在拟南芥不同生育期对其进行表型分析,发现转基因型拟南芥的根系长度,侧根的数量,叶片表面积,分枝茎数量明显高于野生型拟南芥。4.通过测定转基因型和野生型拟南芥中总游离氨基酸含量和可溶性蛋白含量,明确转基因型拟南芥中总游离氨基酸含量和可溶性蛋白质含量明显高于野生型拟南芥,符合表型分析结果。通过测定不同生育期(出苗期,抽薹期,开花期)转基因型拟南芥植株ZmAAP基因的组织表达情况,发现ZmAAP基因在叶片中的表达量最高。将ZmAAP基因的表达量与总游离氨基酸含量和可溶性蛋白质含量进行了相关性分析,结果表明ZmAAP基因表达量的变化与总游离氨基酸含量呈现显著正相关性。因此,明确ZmAAP基因在拟南芥中的表达能够提高拟南芥中氨基酸的含量。
【图文】：

电泳图,部分序列,玉米,电泳

AAP 基因全长 cDNA 的克隆段的扩增：根据 NCBI 中发布的拟南芥和大麦中 AAP1 基因的氨基设计 1 对简并引物 A1、A2，以玉米叶片总 RNA 为模板，以 Oligd cDNA，利用简并引物进行 RT-PCR 反应，扩增出 355bp 的片段（因部分序列测序结果与拟南芥、大麦 AAP 基因比对结果如图 2-3 所P 基因全长 cDNA 的克隆：通过中间片段的碱基序列在 NCBI 中 B能的玉米基因片段，以合成的玉米 cDNA 为模板，B1、B2 为引物，经 1%琼脂糖凝胶电泳，在 1400bp 处出现特异性片段，大小与预测收，连接，转化，后对其进行质粒双酶切验证（图 2-5）。测序结因测序序列与玉米基因组未知功能基因的相似性达到 99.67%（图得到玉米 AAP 基因片段 1396bp。M.DL2000Marker1.为总RNAM.DL2000Marker1.TotalRNA图2-1玉米总RNA的电泳图1ElectrophoresisoftotalRNAfrommaizeM.DL2000 Marker 1.PCR 产物M.DL2000 Marker 1.PCR produc图 2-2 玉米AAP基因的部分序列电泳Fig.2-2 Partial sequence electrophoresis results of

多聚核苷酸,大麦,拟南芥,基因

2.3.1.2 玉米 AAP 基因全长 cDNA 的克隆中间片段的扩增：根据 NCBI 中发布的拟南芥和大麦中 AAP1 基因的氨基酸序列，在基因保守区设计 1 对简并引物 A1、A2，以玉米叶片总 RNA 为模板，，以 OligdT 为反转录引物，合成 cDNA，利用简并引物进行 RT-PCR 反应，扩增出 355bp 的片段（图 2-2）。玉米 AAP 基因部分序列测序结果与拟南芥、大麦 AAP 基因比对结果如图 2-3 所示。玉米 AAP 基因全长 cDNA 的克隆：通过中间片段的碱基序列在 NCBI 中 BLAST 得到一段未知功能的玉米基因片段，以合成的玉米 cDNA 为模板，B1、B2 为引物，在进行 PCR扩增。产物经 1%琼脂糖凝胶电泳，在 1400bp 处出现特异性片段，大小与预测值相符（图2-4）。经回收，连接，转化，后对其进行质粒双酶切验证（图 2-5）。测序结果显示玉米全长 AAP 基因测序序列与玉米基因组未知功能基因的相似性达到 99.67%（图 2-6），表明成功分离得到玉米 AAP 基因片段 1396bp。M.DL2000Marker1.TotalRNA图2-1玉米总RNA的电泳图Fig.2-1ElectrophoresisoftotalRNAfrommaizeM.DL2000 Marker 1.PCR products图 2-2 玉米AAP基因的部分序列电泳结果Fig.2-2 Partial sequence electrophoresis results of maize AAP
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S513

【参考文献】