GmLEC1-A的功能分析及互作基因的筛选

发布时间：2020-06-03 01:23

【摘要】：LEAFY COTYLEDON1(LEC1)是胚胎发育与种子成熟过程中的关键调节因子,可以调控胚胎发育,且使胚胎获得抵抗干燥的能力,抑制种子的过早萌发。在拟南芥中AtLEC1已被深入研究,lec1突变体胚胎不耐受干燥,并表现出几种成熟特异性基因的表达缺陷,其特点包括不耐受干燥的胚胎可在种子干燥前被救活并且不表现任何明显的突变表型。LEC1的异位表达能够激活FUS3,FUS3可促进ABA合成,引起ABA水平的增加。且ABA在植物生长发育中具有重要的作用,它不仅能调控种子成熟阶段和萌发阶段,其含量与植物的再生能力也有着密不可分的关系。研究结果表明,外源ABA可以提高继代培养和分化培养中植物的再生率,内源ABA的含量与愈伤组织形成植株的再生率呈正相关关系。本实验室前期经过同源克隆,克隆出GmLEC1-A、GmLEC1-B基因,本研究中,我们选取GmLEC1-A基因,对其进行亚细胞定位并对蛋白表达进行分析;分别对拟南芥和大豆进行遗传转化,用外源ABA对拟南芥转化植株进行处理,并测定大豆转化植株中ABA的含量且与对照进行对比,目的是明确GmLEC1-A基因的功能,并探究GmLEC1-A基因在大豆再生体系中所产生的作用;进而为了提高大豆再生率,利用基因工程手段对大豆进行改良,为建立高效、稳固的大豆再生体系奠定良好的基础;最后,通过转化植株的表型对GmLEC1-A基因的功能进行初步分析,进而使其在实际农业生产应用上发挥重要的作用。主要实验结果如下:1.对GmLEC1-A基因进行亚细胞定位分析,结果表明GmLEC1-A基因定位在细胞核中。2.构建pET-29b-GmLEC1-A重组载体,进行蛋白表达分析,结果表明GmLEC1-A蛋白大小为35kDa左右。3.进行拟南芥遗传转化,成功获得3个T_3代过表达转基因lec1/GmLEC1-A株系,将转基因lec1/GmLEC1-A、野生型和干燥前被救活的lec1突变体拟南芥种植到0,1,2,3μM浓度ABA的MS培养基中,结果表明,在不含ABA的培养基中,过表达拟南芥的萌发率较低,而突变体与野生型拟南芥基本相同。随着ABA浓度不断增大,突变体拟南芥萌发率受ABA影响较小,而过表达拟南芥对ABA十分敏感,萌发率逐渐降低。4.进行大豆遗传转化,成功获得4株T_2代转基因大豆植株,对其进行表型分析、萌发分析、测定其ABA含量并且对簇生芽进行电镜分析,结果表明,过表达大豆萌发与生长相对迟缓;在萌发前,对照组和过表达大豆种子的ABA含量均随时间的推移而降低,但过表达大豆种子中的ABA含量显着高于对照种子;过表达大豆簇生芽细胞分裂较快。5.构建了酵母表达载体pGBKT7-GmLEC1-A,转化酵母细胞,验证了pGBKT7-GmLEC1-A不存在转录激活活性;构建GmMAPK3酵母表达载体pGADT7-GmMAPK3,通过酵母双杂交实验,证实GmLEC1-A可以与GmMAPK3相互作用。
【图文】：

载体,基因定位,烟草叶片,重组载体

3-1 pEarleyGate101-GmLEC1-A 载体图e vector diagram of pEarleyGate101-GmL片法将重组载体瞬时转化烟草叶片，注射ate101-GmLEC1-A-EYFP 表达融合蛋白的作为对照。如图 3-2 显示：pEarleyGatemLEC1-A 基因定位在细胞核中。

荧光图像,亚细胞定位

注：A 为叶绿体；B 为黄色荧光图像；C 为白光图像；D 为重合图像图3-2 GmLEC1-A的亚细胞定位Fig.3-2 Subcellular localization of GmLEC1-A3.2 GmLEC1-A 基因的蛋白表达含有重组载体 pET-29b-GmLEC1-A 的 BL21(DE3)菌液活化至 OD600=0.6 后，分别加入 0.0.5mM 的 IPTG，诱导 4.5h，经 SDS-PAGE 电泳检测结果显示，在 35kDa 左右处出现目的白如图 3-3，，表明该蛋白已成功表达。
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q943.2

【参考文献】