菊花的抗低温基因挖掘及DgWRKY4抗盐性鉴定

发布时间：2020-06-03 05:49

【摘要】：菊花是我国十大传统名花和世界四大切花之一,观赏和经济价值极高。目前,切花菊在设施栽培的周年生产中,冬季低温环境及土壤盐渍化问题严重影响了切花菊的生产和品质。因此,培育抗低温耐盐菊花新品种已成为切花菊育种的一个重要目标。本研究结合转录组测序和生理指标测定的结果,对切花菊响应低温胁迫机制进行了初步探讨,挖掘出潜在的抗低温优良基因,并鉴定了DgWRKY4基因的耐盐功能,为培育抗低温耐盐菊花新品种提供了有效的基因储备。本研究建立了菊花叶在不同低温环境条件下的四个cDNA文库:(T01)正常温度条件(25±2℃),作为对照;(T02)4℃,24h;(T03)先4℃处理24h(冷驯化过程),后-4℃处理4h;(T04)-4℃,4h,并对其进行转录组测序(q值0.01,FC(Fold Change)≥2),共得到93837条unigene,其中36462条得到注释,7583条为差异表达基因。研究挖掘出大量抗低温基因,主要涉及与低温传感和信号转导、膜稳定性、活性氧清除、渗透调节等方面。本研究将经过冷驯化处理和未经冷驯化处理的菊花幼苗置于相同的冻害条件下处理。生理测定结果表明,未经过冷驯化的菊花(T04)明显比经受过冷驯化阶段的菊花(T03)萎蔫地更快;且经过冷驯化菊花的抗氧化酶(POD和CAT)活性、脯氨酸含量和可溶性糖含量均高于未经冷驯化的菊花,电导率、H_2O_2和O_2~-的累积量低于未经冷驯化的菊花。转录组测序结果表明,T03比T04有更多基因的表达水平上调,且T03菊花中部分响应低温的关键基因的上调幅度明显大于T04菊花。研究表明:冷驯化过程有利于菊花抗低温机制的建立和耐冻性的提高。本研究鉴定了转DgWRKY4基因菊花对盐胁迫的耐受性。试验表明,DgWRKY4能受到NaCl的诱导表达,在正常条件下,野生型菊花不同组织中DgWRKY4的表达水平为叶茎根。在正常生长条件下,转基因菊花和野生型菊花在生长发育上没有明显差异。而在盐胁迫下,当野生型菊花萎蔫、变黄时,转基因菊花依然长势良好,其存活率较高。经生理测定发现,在盐胁迫下,转基因菊花的叶绿素含量、净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)和蒸腾速率(Tr)均高于野生型菊花;且转基因菊花较野生型菊花有较低的丙二醛(MDA)、H_2O_2、O_2~-含量,较高的脯氨酸和可溶性糖含量以及较高的抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性。运用qPCR技术对DgWRKY4下游抗性相关基因的表达量进行检测发现,在盐胁迫下,转基因菊花中编码ROS清除酶的DgCuZnSOD,DgCAT,DgAPX基因和编码脯氨酸合成酶的DgP5CS基因的表达水平均显著高于野生型菊花,此外DgWRKY4还诱导了其他转录因子的上调表达。以上研究为培育抗低温耐盐新品种提供了有效的基因储备。
【图文】：

基因数量,百分比,数据库

数据库Database注释基因数量Annotated gene number百分比PercentageCOG 10226 10.90%GO 19534 20.82%KEGG 12584 13.41%KOG 20400 21.74%Pfam 24137 25.72%Swiss-Prot 23437 24.98%eggNOG 33201 35.38%Nr 35370 37.69%All Annotated 36462 38.86%Total Unigenes 93873

功能分类,转录组,菊花,基因

图 2-2 菊花转录组的 GO 功能分类Fig. 2-2 GO classification of the annotated genes.基于 KOG 数据库的预测，本研究将 20400 个基因分为 25 个功能分类。在这些分，，基因注释到最多的类别为：一般功能预测μ、翻译后修饰，蛋白质周转，伴侣μ、转导机制μ、碳水化合物转运和代谢μ、次生代谢产物合成，运输和分解μ等。详OG 分类结果如图 2-3.
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S682.11

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