Laron综合征患者临床特征总结及生长激素受体基因突变的细胞学功能研究

发布时间：2020-06-03 15:16

【摘要】：第一部分Laron综合征患者临床特点总结目的:总结Laron综合征患者的临床特点及基因检测结果,并比较不同种族Laron综合征患者的临床特点。研究对象和方法:1.收集临床资料:收集2012年至2017年就诊于我院内分泌科的Laron综合征患者的临床资料及血清学检查结果,包括血常规、肝肾功、甲状腺功能、血清GH和IGF-1水平。每个患者分别进行2项生长激素激发实验,分别于用药前及用药后30分钟、60分钟、90分钟、120分钟采集外周血清测定GH浓度。影像学检查包括鞍区核磁及左手腕关节骨龄相。2.采集外周全血进行GHR基因外显子测序:签署知情同意书后,采集患者及家属外周全血标本,提取外周血白细胞DNA,设计引物扩增GHR基因,测序结果在NCBI数据库中比对,运用软件对新发突变进行功能预测。3.系统综述:在Pubmed、万方、知网数据库中分别运用英文和中文关键词“Laron syndrome”,、“growth hormone insensitivity”,、“Laron-type dwarfism”.“growth hormone resistance syndrome”、“Laron综合征”、“生长激素不敏感综合征”、“Laron型侏儒”、“生长激素抵抗”检索文献,正文内对每个患者的临床资料都有描述的文献予以纳入。结果:1.临床资料:共纳入4例Laron综合征患者,均为男性,平均起病年龄为2.5岁(1.0岁-6.0岁),平均诊断年龄为7.6岁(3.5岁-14.3岁),在起病平均5.1年后,获得明确诊断。患者身高SDS中位数为-4.73(-6.71～-2.80),体重SDS中位数为-2.58(-2.96～-1.82),身高落后较体重落后更为显著。患者4具有Laron综合征的典型面容(前额突出、鼻梁塌陷、中面部发育不良),其余3例患者面容无明显异常。4例Laron综合征患者GH基础值分别为15.44ng/ml、2.1Ong/ml、9.60ng/ml和1.59ng/ml(正常范围:2.0Ong/ml),GH激发实验后峰值分别为23.36ng/ml、31.70ng/ml和33.80ng/ml,患者2未行GH激发试验。患者1血清IGF-1浓度为32ng/ml,其余3例均低于检测范围下限(25ng/ml)。所有患者均存在骨龄延迟,分别较实际年龄落后12个月、6个月、28个月和24个月,患者骨龄较实际年龄平均延迟17.5个月。4例患者中患者1和患者4接受过rhGH治疗,患者1治疗剂量为0.053 mg/kg/d,共治疗2月,治疗后身高增加3.30cm。患者4治疗剂量为0.057mg/kg/d,共治疗10月,治疗后血清IGF-1水平仍然小于25ng/ml,治疗后身高增加5.75cm。2.GHR基因外显子测序:4例患者中共发现5种SNP位点,分别为c.1483CA(p.P495T)和c.1630AC(p.I544L)(患者 1);c.558AG(p.G186G)、c.1319GT(p.C440F)和c.1735(p.P579T)(患者2)。1个基因突变位点既往有过报道,此位点为c.587AC(p.Y196S)(患者4)。此外,患者2-4各发现1个新的突变位点,分别为c.808AG(p.I270V)(患者 2)、c.766CT(p.Q256X)(患者 3)和c.1707-171 Ode1(p.E570fs)(患者4)。软件功能预测结果提示p.I270V为良性变异,p.Q256X和p.E570fs为致病性突变。3.中国Laron综合征患者临床特点:文献报道中国Laron综合征患者共计35名(含本研究4例),男女比例为27:8(3.4:1),平均年龄为9.1±3.4岁(2.2岁-15.0岁),中位身高SDS为-4.40(Q1,Q3:-5.90,-2.67)。生长激素激发实验后中位GH峰值为 17.01 ng/ml(Q1,Q3:14.56,33.20)。IGF-1 SDS平均值为-2.65±0.55(N=23),IGFBP-3 SDS平均值为-1.82±1.16(N=17)。共有13名患者具有GHR基因突变,共计10种突变类型,不同突变类型的患者之间身高无明显差异。3名患者发现IGFALS基因突变,身高缺陷较轻,身高SDS中位数为-2.66。4.不同种族之间Laron综合征患者临床特点的比较:比较13名土耳其患者、9名印度患者、35名欧洲患者和35名中国患者的临床特点,结果发现中国患者的诊断年龄明显晚于欧洲患者,中位诊断年龄中国患者为9.0岁,欧洲患者为5.7岁(P=0.004)。土耳其患者身高缺陷较中国患者更为严重,二者身高SDS分别为-7.4和-4.4(P=0.001)。土耳其患者生长激素激发试验后GH峰值明显高于欧洲和中国患者(P值分别为0.003和0.000)。结论:1.Laron综合征是一类罕见的导致矮小的遗传性疾病,本研究收集的4例患者,3例发现有GHR基因的新突变位点。患者临床表现异质性较大,GH基础值和GH激发试验GH峰值都增高,但是IGF-1均较低。部分患者对rhGH治疗有一定反应性。随着测序技术的不断发展,越来越多的患者可以获得明确的遗传学诊断。2.在土耳其、印度、欧洲和中国患者中,中国患者诊断年龄最晚,土耳其患者身材矮小最严重,GH激发实验后GH峰值最高。第二部分GHR基因突变的细胞学功能研究目的:对临床发现的GHR基因新发突变位点进行细胞学水平的功能研究。方法:构建表达GHR基因的野生型及3种突变型的质粒载体(pcDNA3.1-GHR-WT、pcDNA3.1-GHR-Y196S、pcDNA3.1-GHR-Q256X、pcDNA3.1-GHR-E570fs)。采用阳离子脂质体转染试剂,将野生型和突变型GHR质粒分别转染进人胚肾HEK293T细胞及人肝癌HepG2细胞。48小时后,采用蛋白免疫印迹法(Westernblot,WB),检测细胞内GHR蛋白的表达情况。采用免疫荧光染色法,荧光显微镜下观察转染后细胞内GHR蛋白的分布情况。100ng/ml rhGH作用于转染野生型及3种突变型GHR表达质粒的HepG2细胞30分钟后,采用WB方法,检测细胞内磷酸化STAT5蛋白的表达情况。l00ng/ml rhGH作用于转染野生型及3种突变型GHR表达质粒的HepG2细胞24小时后,采用实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)法,检测细胞内IGF1基因mRNA水平的相对表达量;同时留取细胞培养液,用酶联免疫吸附法(ELISA),检测细胞培养液中IGF-1蛋白的浓度。结果:1.转染后细胞内GHR蛋白的表达量:分别转染野生型及3种突变型GHR表达质粒于HEK293T细胞和HepG2细胞后,采用抗HA标签的抗体进行WB检测,结果发现,野生型GHR和Y196S突变型GHR蛋白,均在分子量为130kDa处有一明显的条带,但是野生型GHR蛋白表达量较Y196S突变型GHR蛋白的表达量高28.9%,差异具有显著性(P0.05)。Q256X突变型由于产生截短蛋白,因此在分子量为43kDa处出现特异性条带,而且其表达量较野生型GHR蛋白减少47.0%(P0.05)。E570fs突变是4个碱基缺失导致的移码突变,在上述130kDa、43kDa以及其它低分子量处,均未检测到特异性条带。采用抗GHR的特异性抗体进行WB检测,也获得了相似的结果。2. GHR蛋白免疫荧光染色:转染野生型和3种不同突变型GHR表达质粒48小时后,固定细胞,采用抗HA标签抗体进行免疫荧光染色,荧光显微镜观察发现,在HEK293T细胞和HepG2细胞中,野生型GHR蛋白在细胞膜表面均匀分布,Y196S突变型GHR蛋白在细胞内的分布模式与野生型类似,均匀分布在细胞膜上;Q256X和E570fs突变型GHR蛋白与野生型GHR蛋白分布模式不同,突变型GHR蛋白在细胞浆内围绕细胞核呈“戒指状”分布,在胞浆内细胞核一侧有局限性的绿色荧光浓聚。3.转染后HepG2细胞中磷酸化STAT5的表达量:在转染野生型和3种突变型GHR表达质粒的HepG2细胞培养液中,加入lOOng/mlrhGH作用30分钟后,采用抗磷酸化的STAT5抗体进行WB检测,结果发现,与转染野生型质粒的HepG2细胞相比,转染Y196S、Q256X和E570fs突变型GHR质粒的HepG2细胞中,磷酸化STAT5的表达量显著下降,分别降低了32.7%、40.6%和29.6%(P0.05)。4. rhGH作用后HepG2中IGF1基因mRNA的表达量:转染野生型和3种突变型质粒的HepG2细胞,加入100ng/ml rhGH作用24小时后,采用qRT-PCR法检测IGFlmRNA的表达量,结果发现,与转染野生型GHR质粒的HepG2细胞相比转染Y196S和Q256X突变型GHR质粒细胞的IGFlmRNA表达量无明显减少,但是转染E570fs突变型GHR质粒的细胞,IGF1 mRNA表达量却较野生型明显增高,增氋了64.1%(PC0.05)。5. rhGH作用后HepG2细胞培养液中IGF-1蛋白的浓度:在转染野生型和3种突变型质粒的HepG2细胞培养液中加入lOOng/mlrhGH,作用24小时后,采用ELISA检测细胞培养液中IGF-1的水平,结果发现,转染野生型GHR质粒的细胞培养中,IGF的浓度为71.88 pg/ml,转染3种突变型GHR质粒的IGF-1浓度分别为94.80pg/ml,95.63 pg/ml和95.63 pg/ml,各组之间IGF-1蛋白浓度无显著差异(P=0.238)。结论:1.Y196S突变型GHR蛋白表达量较野生型GHR明显降低,其在细胞中的分布和野生型没有明显差异,但是其激活GH受体后信号通路上STAT5的能力减低。2.Q256X突变后产生分子量约43kDa的截短蛋白,其表达量明显低于野生型GHR,Q256X突变型蛋白滞留于细胞质中,对STAT5信号分子的激活能力明显减弱。3.E570fs突变型GHR蛋白分子量大小未知,其蛋白滞留于细胞质中,对STAT5信号分子的激活能力减弱。
【图文】：

外显子,杂合,患者,基因

一，ｃ．８０８Ａ＞Ｇｐ．Ｉ７０Ｖ、ｃ．７６６Ｃ＞Ｔｐ．Ｑ５６Ｘ．邋１７０７－１７１邋Ｏｄｅｌ邋（ｐ．Ｅ５７０ｆｓ）。逡逑患者１检测出ＧＨＲ基因的复合杂合变异，均位于第１０外显子上（Ｐ４９５Ｔ５４４Ｌ，图邋１－１）0逡逑Ａ＊邋■？？＊？？？？邋？逦．邋．邋Ｖ邋？邋？邋？邋■邋？邋■邋Ｑ邋＇逦！逦＊逦！逦？逦：逦？逦！逦！邋ｆ邋！逡逑１逦５：逡逑

家系图,家系图,患者

患者４含有两个复合杂合突变位点，分别为Ｙ１９６Ｓ和Ｅ５７０ｆｓ，，其中Ｙ１９６Ｓ突逡逑变来自于母亲，是一个错义突变；Ｅ５７０ｆｓ突变来自于父亲，由于连续缺失了邋４个碱逡逑基，造成密码子的阅读框发生改变（图１－５）。逡逑Ａ＊逦？逦？逦■逦．逦Ｄ邋＇逦■？？？＊－－逦逡逑３邋ｉ邋Ｓ邋３邋Ｓ邋３逦３逦：邋Ｓ逡逑ｔ逡逑Ｊｈ邋Ｉ邋ｉ邋｜｜邋＾逦—逡逑Ｅｘｏｎ邋６邋ｃ．５８７Ａ＞邋Ｃ逦Ｅｘｏｎ邋１０邋ｃ．１７０７－１７１邋Ｏｄｅｌ逡逑ｃ邋１邋□￣￣ｒ－0逡逑ｎ邋ｒ逡逑图１－５患者４基因检测结果（Ａ、Ｂ）和家系图（Ｃ）。逡逑注：男性致病基因携带者，Ｑ女性致病基因携带者，先证者逡逑分别用在线软件对上述新发现的突变位点进行功能预测，以初步判断突变是否逡逑会影响基因的功能。结果发现，ＳＩＦＴ、ＰｏｌｙＰｈｅｎ－２和Ｍｕｔａｔｉｏｎ邋Ｔａｓｔｅｒ软件预测Ｉ２７０Ｖ逡逑突变为良性变异；Ｍｕｔａｔｉｏｎ邋Ｔａｓｔｅｒ预测Ｑ２５６Ｘ和Ｅ５７０ｆｓ突变均为致病突变（表１－６）。逡逑２２逡逑
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R725.8

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