草莓二氢黄酮醇-4-还原酶基因的克隆及功能鉴定

发布时间：2020-06-03 22:02

【摘要】：草莓(Fragaria×ananassa Duch.)属蔷薇科草莓属草本植物。草莓含有大量的黄酮类物质,这些物质不仅使其色泽鲜艳,还具有多种保健功能,因而草莓备受消费者青睐。花青素和原花青素都是非常重要的黄酮类物质,它们均具有较强的抗氧化作用,可以帮助人体抗衰老、预防癌症和抵御心血管疾病等。花青素还是天然的水溶性色素,大部分被子植物果实和花的颜色都是由花青素决定的。二氢黄酮醇-4-还原酶(dihydroflavonol-4-reductase,DFR)是花青素和原花青素合成途径中非常关键的酶,可催化3种二氢黄酮醇和两种黄烷酮生成5种不同的花青素前体。这些不同的花青素对植物组织和器官产生丰富的颜色十分重要。而原花青素是一种花青素(矢车菊素)的还原产物形成的单倍体或聚合体。因此DFR对花青素和原花青素的形成均十分重要。本研究通过对草莓转录组数据进行分析,发现了一个蓝光和白光下差异表达的DFR基因,并且蓝光处理下花青素的含量较白光处理明显增多。此DFR与NCBI中已经登录的草莓DFR基因序列差异明显。研究该基因的功能对深入理解DFR基因家族的功能具有重要的意义。本实验通过克隆得到此DFR基因的CDS区以及启动子序列,利用qRT-PCR测定该基因在草莓中的时空表达,并通过原核表达获得DFR重组蛋白进行体外酶催化实验和拟南芥体内过表达此DFR,双向验证该基因的功能。获得的主要结果如下:(1)根据本实验室转录组数据库数据对DFR基因克隆,获得了一条长1065 bp的DFR序列,将其命名为FaDFRL,该序列编码的氨基酸与草莓中其他FaDFR编码的氨基酸序列相似性仅35%。FaDFRL具有DFR基因家族典型的NADPH结合域和底物结合区。在线预测FaDFRL启动子的功能发现,该启动子中有多个光响应元件和激素响应元件。(2)FaDFRL基因在蓝光处理下花后14 d的草莓果实中表达量显著高于其他处理,在红光处理花后25 d的草莓果实中其表达量也显著高于其他处理。表明FaDFRL在褪绿期受蓝光诱导,在成熟期受红光诱导。(3)通过原核表达获取FaDFRL蛋白酶,并使用HPLC检测该蛋白酶的功能发现,FaDFRL蛋白酶对草莓中主要存在的两个底物二氢山柰酚和二氢槲皮素均没有催化作用。通过构建过表达载体并转入拟南芥获得了T3代纯合转FaDFRL基因株系。经qRT-PCR鉴定,该基因在拟南芥中过表达成功,然而拟南芥中花青素和原花青素的含量相对于野生型均没有明显提升。但因拟南芥中花青素含量极低,不太适用花青素相关研究。因此需要将FaDFRL基因转入草莓中进一步确认其功能。此外,转基因拟南芥受蓝光照射后FaDFRL的表达量明显降低,推测蓝光对FaDFRL的调控为转录后调控。且根据前人的研究推测,FaDFRL基因可能与植物的抗逆性相关。
【图文】：

花青素,原花青素,生物合成途径

四川农业大学 2018 届硕士学位论文牛中却产生了砖红色矮牵牛花。因此，DFR 对底物的选择是决定着植物中花色苷的种类的重要因素并在很大程度上决定花色苷的比例。使植物最终呈不同的颜色。此外有研究发现 DFR 还可作为黄烷酮 4-还原酶（flavanone 4-reductase，FNR），催化柚皮素和圣草酚生成黄烷-4-醇（flavan-4-ols），，进而在其他酶的作用下形成 3-脱氧花青素（3-deoxyanthocyanidin），这不仅使植物呈现出橙红色（图 1），而且 3-脱氧花青素及其中间代谢产物五羟基黄酮（luteoforol）还可作为防御物质抵御真菌和细菌侵害[21-23]

重组质粒,名称,用量,连接反应

组份名称用量Components Amount added10x Buffer 2.1 5 μLNco I 1 μLEcoR I 1 μL目的基因/pET-32a+1 μgddH2O 补足至 50 μL表 3 连接反应体系Table 3 Connection system组份名称用量Components Amount addedpET-32a+载体 1 μL目的基因 7 μLT4DNA 连接酶 1 μL10x T4DNA Buffer 1 μL
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S668.4

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